脈沖電磁刺激對糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響

李蘭，楊偉偉，王楠

西安市第九醫(yī)院麻醉科，陜西西安710054

前言

糖尿病是一種最為常見的內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)慢性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界約有4.15億的糖尿病患者，而到2040年糖尿病患者可能會增加至6.4億，糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的重要疾病之一［1-2］。隨著我國老齡化的推進(jìn)，糖尿病人口也在逐年增加。糖尿病被醫(yī)學(xué)界稱為“萬病之源”，它可以誘發(fā)機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生并發(fā)癥，如糖尿病血管病變、糖尿病腎病、眼底病變、糖尿病足、糖尿病骨骼疾病等。而機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)也同樣受到糖尿病的侵害［3］，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛（DiabeticNeuropathic Pain,DNP）是糖尿病臨床上最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，它也被認(rèn)為是糖尿病最復(fù)雜和最嚴(yán)重的系統(tǒng)并發(fā)癥［4-5］。DNP主要由于機(jī)體長期處于高糖狀態(tài)下誘發(fā)正常痛覺信號系統(tǒng)受損或功能紊亂引起，這一損傷可以累及全身各處神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生功能異常（如運(yùn)動神經(jīng)、感覺神經(jīng)、自主神經(jīng)等）。DNP的主要臨床癥狀表現(xiàn)為自發(fā)疼痛、痛覺過敏或異常以及感覺過敏等特征，它也是糖尿病患者足部潰瘍形成的主要危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重影響著病患身體健康和心理狀態(tài)，降低患者的生活質(zhì)量［6］。目前，臨床上對于DNP的治療主要通過服用鎮(zhèn)痛藥物，如曲馬多、對乙酰氨基酚、嗎啡等，但是這些藥物不僅對不同個(gè)體的作用效果差異性較大，并且會產(chǎn)生諸多藥物副反應(yīng)［7］。因此，探尋有效且安全的緩解DNP的方法是目前臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。外源性的電磁干預(yù)作為臨床上常見的一種物理因子治療方法，其對于神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用已經(jīng)得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，脈沖電磁刺激能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)損傷的結(jié)構(gòu)再生和功能恢復(fù)［8-9］。同時(shí)，諸多的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究也揭示了外源性的脈沖電磁刺激能夠?qū)C(jī)體的疼痛癥狀產(chǎn)生顯著的緩解作用［10-12］。這些研究均提示，外源性的脈沖電磁刺激能夠?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)的諸多疾病產(chǎn)生積極的調(diào)控效應(yīng)，有望廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療。但是，脈沖電磁刺激是否能夠緩解DNP，目前國內(nèi)外對于這一問題的研究尚屬空白。本研究旨在從疼痛敏感性（機(jī)械痛閾和熱痛閾）和神經(jīng)傳導(dǎo)功能（感覺神經(jīng)和運(yùn)動神經(jīng)）系統(tǒng)探究外源性脈沖電磁刺激對糖尿病大鼠DNP癥狀的改善效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

麻醉劑戊巴比妥鈉溶液，購于美國Sigma公司；鏈脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）溶液，購于美國Sigma公司；電子天平（AEG-120T），購于日本Shimadzu公司；OneTouch穩(wěn)步型便攜式血糖測量儀，購于美國Lifescan公司；機(jī)械痛閾值測定用Von Frey 纖毛，購于美國Stoelting公司；用于神經(jīng)傳導(dǎo)速率測定的生物信號采集系統(tǒng)記錄，購于成都泰盟科技有限公司。

1.2 動物模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組

年齡為16～18周的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔程度為無特定病原體（Specific Pathogen Free,SPF）級，體質(zhì)量290～310 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有動物飼養(yǎng)于恒定溫度［（23±1）℃］和恒定濕度（50%～60%）環(huán)境，人工光照，明暗時(shí)長各12 h。實(shí)驗(yàn)中共使用30只大鼠，將所有大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為：空白對照（Control）組、DNP組以及DNP協(xié)同電磁刺激（Electromagnetic Radiation,EMF）（DNP+EMF）組。對DNP組和DNP+EMF組的20只大鼠構(gòu)建胰島素依賴型糖尿病動物模型。大鼠行一次性腹腔注射STZ溶液50mg/kg，Control組的10只大鼠行一次性腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液作為對照。STZ溶液注射3 d后，使用便攜式血糖儀測定各組大鼠的隨機(jī)血糖值。測量結(jié)果顯示，DNP組和DNP+EMF組的全部大鼠隨機(jī)血糖值均高于16.7 mmol/L，故認(rèn)定為模型建立成功［13］。通過大鼠體征觀察進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了STZ注射的大鼠表現(xiàn)出明顯的消瘦和“三多”（多飲、多食和多尿）等與胰島素依賴型糖尿病類似的典型臨床體征。糖尿病模型構(gòu)建成功后，對于DNP+EMF組大鼠行外源性的電磁刺激干預(yù)，每天刺激6 h，連續(xù)刺激8周。

1.3 電磁刺激系統(tǒng)

本研究中所使用的脈沖電磁刺激系統(tǒng)為第四軍醫(yī)大學(xué)研制的GHY-1型電磁刺激儀。該脈沖電磁刺激系統(tǒng)主要由信號發(fā)生器和Helmholtz線圈兩部分組成。該脈沖電磁刺激儀正常工作狀態(tài)下的輸入電壓（220±22）V、頻率50 Hz，額定功率≤70 W。Helmholtz線圈由兩個(gè)等軸且并排放置的圓形線圈組成（線圈直徑為80 cm，線圈匝數(shù)為500匝，線圈間距為40 cm），采用0.8 mm 銅線繞制。輸出的電磁場信號為15 Hz的準(zhǔn)脈沖群、5 ms延時(shí)脈沖群的刺激波形，脈沖電磁場的刺激峰值強(qiáng)度為30 Gauss，所誘發(fā)的感應(yīng)電流峰值強(qiáng)度為3 mV/cm。在整個(gè)脈沖電磁場刺激過程中，大鼠飼養(yǎng)于有機(jī)玻璃籠內(nèi)，大鼠能夠在籠內(nèi)自由飲水和進(jìn)食。Control 組和DNP 組大鼠同樣置于Helmholtz線圈內(nèi)，但不施加以電磁刺激作為假暴露。

1.4 大鼠足底機(jī)械痛閾值測定

在糖尿病動物模型構(gòu)建前以及構(gòu)建成功（即電磁刺激）的第2、4、6、8周對大鼠的足底機(jī)械痛閾值進(jìn)行測定。大鼠置于有機(jī)玻璃的籠罩中，籠罩尺寸為26 cm×20 cm×14 cm，底部為金屬絲制備成的網(wǎng)格墊，實(shí)驗(yàn)前將大鼠處于靜息狀態(tài)下30 min。實(shí)驗(yàn)時(shí)環(huán)境溫度控制在（21±1）℃。使用Von Frey纖毛通過自下而上的順序垂直刺激大鼠足底，以纖毛發(fā)生肉眼可見的彎曲當(dāng)作完全受力的標(biāo)準(zhǔn)。以2、4、6、8、10、15和26 g的順序，依次通過Von Frey纖毛刺激動物，當(dāng)動物出現(xiàn)快速的抬足和舔足反應(yīng)時(shí)，迅速記錄動作發(fā)生的時(shí)間（出現(xiàn)了陽性反應(yīng)），若3 次不抬腿，換用更高克數(shù)的纖毛；每只動物測量3 次，取3 次測量的平均值作為該大鼠的機(jī)械痛閾值。

1.5 大鼠足底熱痛閾值的測定

在糖尿病動物模型構(gòu)建前以及模型構(gòu)建成功后（即電磁刺激）的第2、4、6、8周對大鼠的足底熱痛閾值進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)前，將大鼠處于靜息狀態(tài)下30 min，實(shí)驗(yàn)時(shí)環(huán)境溫度控制在（21±1）℃，實(shí)驗(yàn)室維持在安靜環(huán)境。大鼠置于有機(jī)玻璃的籠罩中，通過應(yīng)用意大利Commat公司的熱痛刺激系統(tǒng)輻照大鼠的足底，當(dāng)動物出現(xiàn)快速的抬足反應(yīng)時(shí)，迅速記錄動作發(fā)生的時(shí)間（出現(xiàn)了陽性反應(yīng)），每次實(shí)驗(yàn)刺激3次，每次間隔時(shí)間不低于10 min，取3次測量的平均值作為該大鼠的熱痛閾值。在整個(gè)熱痛閾值測定中，熱刺激的強(qiáng)度始終保持一致。為了避免動物組織燙傷燒傷情況的出現(xiàn)，將自動切斷時(shí)間設(shè)定至25 s。

1.6 大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速率的測定

在糖尿病動物模型構(gòu)建前以及構(gòu)建成功后（即電磁刺激）的第2、4、6、8周對大鼠的感覺神經(jīng)和運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率進(jìn)行測定。對大鼠行腹腔注射濃度為30 mg/kg的戊巴比妥鈉（購于美國Sigma公司）進(jìn)行麻醉，隨后將大鼠放置于鋪有輔熱裝置的平臺上，通過大鼠的角膜反射和縮腿反應(yīng)判斷麻醉是否充分。對于感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率的測量，將2個(gè)刺激電極分別插放入動物的膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)中。對于運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率的測量，將2個(gè)刺激電極分別插放入大鼠的踝關(guān)節(jié)和坐骨切跡上。待放置穩(wěn)定后，將刺激電極通以電流，通過應(yīng)用生物信號采集系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）記錄復(fù)合動作電位的潛伏期（神經(jīng)傳導(dǎo)時(shí)間），同時(shí)測定記錄電極和刺激電極之間的沿著神經(jīng)走向的間隔距離，從而計(jì)算獲得感覺神經(jīng)的傳導(dǎo)速率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。3組大鼠的機(jī)械痛閾值、熱痛閾值、運(yùn)動功能評分、神經(jīng)傳導(dǎo)速率的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間的兩兩比較使用Bonferroni法。P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 外源性電磁刺激對DNP 大鼠足底機(jī)械痛閾值的影響

Control、DNP、DNP+EMF 3組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（第0、2、4、6、8周）的足底機(jī)械痛閾值結(jié)果如圖1所示。DNP組和DNP+EMF組大鼠在第2、4、6、8周的足底機(jī)械痛閾值均顯著低于Control組（P＜0.05），提示DNP大鼠的機(jī)械痛閾值發(fā)生了顯著性降低。與DNP組大鼠相比，DNP+EMF組大鼠的足底機(jī)械痛閾值在第2周并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但是DNP+EMF組大鼠的足底機(jī)械痛閾值在第4、6、8周顯著高于DNP組大鼠（P＜0.05），提示電磁刺激能夠顯著抑制DNP大鼠機(jī)械痛閾值的降低，揭示了外源性的脈沖電磁場刺激能夠有效提高糖尿病大鼠對于外界機(jī)械刺激疼痛的耐受能力。

圖1 電磁刺激對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠足底機(jī)械痛閾值的影響Fig.1 Effects of electromagnetic field stimulation on paw mechanical pain threshold in rats with diabetic neuropathic pain(DNP)

2.2 外源性電磁刺激對DNP大鼠足底熱痛閾值的影響

Control、DNP、DNP+EMF 3組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（第0、2、4、6、8周）的足底熱痛閾值的結(jié)果如圖2所示。DNP組和DNP+EMF組大鼠在第2、4、6、8周的足底熱痛閾值均顯著低于Control組（P＜0.05），提示DNP大鼠的熱痛閾值同樣也發(fā)生了顯著性的降低。結(jié)果進(jìn)一步揭示，相比與DNP組的大鼠，DNP+EMF組大鼠的足底熱痛閾值在第2周并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但是DNP+EMF組大鼠的足底熱痛閾值在第4、6、8周顯著高于DNP組大鼠（P＜0.05），提示電磁刺激同樣能夠顯著性的抑制DNP大鼠熱痛閾值的降低。

2.3 外源性電磁刺激對DNP 大鼠感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率的影響

Control、DNP、DNP+EMF 3 組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（第0、2、4、6、8 周）的感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率比較結(jié)果見圖3。與Control組大鼠相比，DNP組和DNP+EMF組大鼠從第2周開始，其感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率發(fā)生顯著性降低（P＜0.05），且這種降低在第4、6、8周均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。筆者的結(jié)果進(jìn)一步表明，在經(jīng)過外源性的電磁刺激后，DNP+EMF組大鼠的感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率在第2、4、6、8周均顯著高于DNP組大鼠。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性的電磁刺激能夠顯著抑制DNP大鼠的感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率降低。

圖2 電磁刺激對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠足底熱痛閾值的影響Fig.2 Effects of electromagnetic field stimulation on paw thermal pain threshold in DNP rats

圖3 電磁刺激對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率的影響Fig.3 Effects of electromagnetic field stimulation on sensory nerve conduction velocity in DNP rats

2.4 外源性電磁刺激對DNP 大鼠運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率的影響

Control、DNP、DNP+EMF 3 組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（第0、2、4、6、8 周）的運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率比較結(jié)果如圖4 所示。與Control 組大鼠相比，DNP 組和DNP+EMF組大鼠從第2周開始，其運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率發(fā)生顯著性降低（P＜0.05），且DNP 組大鼠相比于Control組大鼠的降低在第4、6、8周均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。同時(shí)筆者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，相比與DNP 組大鼠，DNP+EMF 組大鼠的運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率在第2 周并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但是在經(jīng)過4、6、8周的外源性電磁刺激后，DNP+EMF組大鼠的運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率顯著高于DNP 組大鼠。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性的電磁刺激同樣也能夠顯著性抑制DNP大鼠運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率的降低。

圖4 電磁刺激對糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率的影響Fig.4 Effects of electromagnetic field stimulation on motor nerve conduction velocity in DNP rats

3 討論

低強(qiáng)度的脈沖電磁場作為一種簡單、安全、無創(chuàng)的物理因子治療方法，已被證實(shí)能夠?qū)Χ喾N疾病產(chǎn)生積極的治療效果，包括心血管疾病、軟組織損傷以及骨骼系統(tǒng)疾病等［14-16］。低強(qiáng)度脈沖電磁場對于神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用已被大量國內(nèi)外學(xué)者們研究報(bào)道，主要包括促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)以及緩解各種生理性的疼痛癥狀（如下腰痛、術(shù)后疼痛等）［9-11］。但是，低強(qiáng)度脈沖電磁刺激是否會對DNP產(chǎn)生積極的治療效果，目前國內(nèi)外仍缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。本研究中，筆者構(gòu)建了STZ單次注射誘導(dǎo)的速發(fā)性胰島素依賴型糖尿病動物模型，STZ能夠快速破壞胰島β細(xì)胞的功能，使其喪失分泌胰島素的能力，該方法誘導(dǎo)的糖尿病動物表現(xiàn)出顯著的多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕、血糖顯著升高以及血液胰島素降低的典型的1型糖尿病體征。而STZ注射會誘導(dǎo)DNP的發(fā)生也已被大量研究證實(shí)［17-19］。與前人的研究類似，筆者的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了STZ誘導(dǎo)的糖尿病動物表現(xiàn)出機(jī)械痛超敏、熱痛超敏、神經(jīng)傳導(dǎo)障礙等特征，且上述癥狀能夠在STZ注射的8周內(nèi)持續(xù)維持，這些癥狀與臨床上的DNP癥狀具有相似性，提示模型構(gòu)建成功。但是，筆者并未發(fā)現(xiàn)8周電磁刺激會對糖尿病大鼠的糖尿病體征（體質(zhì)量、血糖）產(chǎn)生顯著影響。因此，脈沖電磁刺激對糖尿病大鼠DNP的調(diào)控效應(yīng)與其對糖尿病癥狀的變化無潛在關(guān)聯(lián)性。

筆者的機(jī)械痛閾值和熱痛閾值測試結(jié)果顯示，對DNP大鼠連續(xù)施加外源性脈沖電磁刺激的第4周開始，DNP誘發(fā)的低機(jī)械痛閾值和低熱痛閾值具有顯著性的提升，并且這一差異在第6和第8周也同樣十分顯著，筆者的結(jié)果提示外源性脈沖電磁刺激可明顯提升DNP大鼠對于外界刺激的疼痛閾值，增加了DNP動物對于疼痛的耐受力并降低對于疼痛刺激的敏感性，提示了外源性的脈沖電磁刺激能夠?qū)NP癥狀的緩解產(chǎn)生積極的作用效果。隨后，筆者的神經(jīng)傳導(dǎo)速率測量研究結(jié)果顯示，DNP組大鼠的感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率和運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率均顯著低于Control組，提示DNP大鼠發(fā)生了顯著的神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙。而經(jīng)過外源性脈沖電磁刺激后的第2周起，DNP+EMF組大鼠感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速率出現(xiàn)了顯著性提升。經(jīng)過脈沖電磁刺激后的第4周起，DNP+EMF組大鼠運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速率也出現(xiàn)了顯著增加。筆者的結(jié)果也揭示了外源性脈沖電磁刺激對DNP的神經(jīng)傳導(dǎo)功能的改善和恢復(fù)方面發(fā)揮了積極的作用效果。并且在整個(gè)8周的實(shí)驗(yàn)過程中，筆者并未發(fā)現(xiàn)DNP+EMF組大鼠對外源性脈沖電磁刺激產(chǎn)生任何明顯的不適和任何不良反應(yīng)，提示了低強(qiáng)度的脈沖電磁刺激的物理因子作用方式是可靠且安全的。

DNP是最為常見的糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其具有機(jī)制復(fù)雜、治愈困難、致殘率高等臨床特點(diǎn)。本研究系統(tǒng)從疼痛敏感性和神經(jīng)傳導(dǎo)速率系統(tǒng)闡明了外源性的脈沖電磁刺激對于糖尿病大鼠DNP表現(xiàn)出良好的作用效果，揭示了外源性的脈沖電磁刺激有望成為臨床治療DNP的一種新的物理治療手段。低強(qiáng)度脈沖電磁場治療具有成本低、經(jīng)濟(jì)便捷、無藥物毒副作用、無創(chuàng)傷等諸多優(yōu)勢，因此具備良好的臨床應(yīng)用前景。但是脈沖電磁場對于DNP的潛在作用機(jī)制還需要未來大量的體內(nèi)外試驗(yàn)進(jìn)一步揭示。在后續(xù)的研究中，筆者將系統(tǒng)探索脈沖電磁場對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響過程和機(jī)制，明確電磁刺激對于刺激感受器、神經(jīng)干和神經(jīng)末梢的響應(yīng)和傳遞過程中所發(fā)揮的作用，同時(shí)筆者也將系統(tǒng)探索激發(fā)神經(jīng)纖維的興奮、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)生長因子的生成、疼痛相關(guān)抑制蛋白的表達(dá)，從而闡釋外源性脈沖電磁刺激對于緩解DNP的潛在調(diào)控機(jī)制。