圓珠半夏帶頂芽塊莖組培快繁體系的構(gòu)建

朱 健， 羅夫來， 趙 致， 王華磊， 羅春麗， 李金玲， 劉紅昌， 黃明進(jìn)

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省中藥材繁育與種植重點(diǎn)(工程)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

半夏是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，有燥濕化痰、鎮(zhèn)吐及催吐、抗腫瘤、抗早孕等作用[1-3]。大方圓珠半夏是貴州省大方縣境內(nèi)種植或野生的半夏(Pinelliaternata)，為天南星科植物，具有個(gè)大色白、棕眼明顯、質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、粉性足等特點(diǎn)，屬于半夏優(yōu)質(zhì)藥材。2012年獲得國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)認(rèn)證。大田種植主要用塊莖播種，用種量大，種子成本高，對(duì)半夏藥材生產(chǎn)造成較大限制。而基于植物組織培養(yǎng)的快繁技術(shù)，具有速度快、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，在種苗繁育研究中被廣泛應(yīng)用。半夏葉片、葉柄、塊莖都可以作為外植體用于組培快繁，且已有較多文獻(xiàn)報(bào)道。筆者所在課題組在進(jìn)行半夏組培快繁研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，以半夏塊莖頂芽或帶頂芽的塊莖切塊為外植體時(shí)，其組織培養(yǎng)快速繁殖所需要的條件與葉片、葉柄、不帶頂芽塊莖所需的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及其組合完全不同。為此，筆者等以圓珠半夏帶頂芽塊莖為外植體開展了頂芽萌發(fā)、愈傷組織和叢生芽誘導(dǎo)等研究，以期為豐富半夏組培快繁資料及半夏種苗繁育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

圓珠半夏：采自貴州省大方縣，為人工種植，經(jīng)鑒定為天南星科植物半夏(Pinelliaternata)。

1.2 方法

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，考察不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其比例對(duì)外植體和培養(yǎng)物的影響。

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 單因素試驗(yàn)。以蒸餾水為對(duì)照，分別研究不同濃度6-BA、NAA、2,4-D對(duì)外植體形成愈傷組織的效應(yīng)。其中，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA 的濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L和2.0mg/L，NAA的濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L和0.8 mg/L，2,4-D的濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L和0.8 mg/L。

2) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以6-BA濃度(A)、NAA濃度(B)和2,4-D(C)為考察因素，設(shè)置4個(gè)水平，采用L16(43)正交試驗(yàn)篩選俞傷組織形成、誘導(dǎo)頂芽萌發(fā)和叢生芽形成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最佳組合。其因素水平見表1。

表1 圓珠半夏帶頂芽塊莖組培的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑因素及水平

Table 1 Factors and levels of growth regulators in tissue culture ofP.ternatawith apical buds

水平Level6-BA/(mg/L)NAA/(mg/L)2,4-D/(mg/L)10 0 0 20.80.10.131.00.20.241.20.30.3

1.2.2 外植體準(zhǔn)備、接種與培養(yǎng) 外植體準(zhǔn)備：選取無病蟲害健壯飽滿的圓珠半夏塊莖，剝?nèi)ケ砥?，用清水沖洗3～5 min，在無菌工作臺(tái)上用75%酒精消毒40 s，用無菌水沖洗2～3次，用0.1%升汞滅菌12～15 min，再用無菌水沖洗3～5次，置滅菌濾紙上吸干水分，備用。

接種與培養(yǎng)：每個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理接種10瓶，每瓶接種3塊帶頂芽塊莖。培養(yǎng)條件為25℃，空氣相對(duì)濕度80%，光照強(qiáng)度2 000～2 500 Lx，光照時(shí)間15 h/d，培養(yǎng)30 d后觀察。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 觀測(cè)并記錄不同處理圓株半夏頂芽塊莖的芽萌發(fā)數(shù)，形成愈傷組織數(shù)及從生芽數(shù)，并計(jì)算芽萌發(fā)率及愈傷組織形成率。

萌發(fā)率=芽萌發(fā)數(shù)/接種數(shù)×100%

愈傷組織形成率=形成愈傷組織數(shù)/接種數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

2.1.1 6-BA 6-BA對(duì)圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織有促進(jìn)作用，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)形成的愈傷組織數(shù)最多，達(dá)26塊，且愈傷組織呈綠色，表面有較多凸起的小顆粒，顯著優(yōu)于其余處理；其余各處理形成的愈傷組織均在20塊以下，且愈傷組織狀態(tài)較差(表2)。因此，6-BA誘導(dǎo)帶頂芽外植體形成愈傷組織的最適濃度為1.0 mg/L。

表2 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的對(duì)圓珠半夏頂芽外植體形成愈傷的誘導(dǎo)效應(yīng)

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level.

2.1.2 NAA NAA對(duì)圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織有顯著促進(jìn)作用，且NAA各濃度處理誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)均顯著高于對(duì)照。當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)最多，達(dá)29塊，且愈傷組織呈綠色，表面有較多凸起的小顆粒，優(yōu)于其余處理，但不同濃度間差異不顯著(表2)。因此NAA誘導(dǎo)帶頂芽外植體形成愈傷組織的最適濃度為0.2 mg/L。

2.1.3 2,4-D 2,4-D對(duì)圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織有促進(jìn)作用，除0.8 mg/L以外，其余各濃度2,4-D處理均顯著優(yōu)于對(duì)照。當(dāng)2,4-D濃度為0.2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)外植體形成的愈傷組織數(shù)最多，達(dá)24塊，且愈傷組織呈綠色，表面有較多凸起的小顆粒，優(yōu)于其余處理，但不同濃度間差異不顯著;其余各處理形成的愈傷組織數(shù)均在20塊以下，且愈傷組織狀態(tài)較差(表2)。因此，2,4-D誘導(dǎo)帶頂芽外植體形成愈傷組織的最適濃度為0.2 mg/L。

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)圓珠半夏組織培養(yǎng)的促進(jìn)作用

2.2.1 塊莖頂芽萌發(fā) 由表3可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 誘導(dǎo)頂芽萌發(fā)的最優(yōu)水平分別為A4、B4和C3，即6-BA 1.2 mg/L、NAA 0.3 mg/L和2,4-D 0.2 mg/L。經(jīng)方差分析表明，6-BA、NAA不同濃度誘導(dǎo)圓珠半夏的頂芽萌發(fā)數(shù)差異達(dá)顯著水平，2,4-D不同濃度誘導(dǎo)圓珠半夏的頂芽萌發(fā)數(shù)差異達(dá)極顯著水平。經(jīng)多重比較表明，A4萌發(fā)數(shù)最多，A2、A3、A4均極顯著高于A1，但A2、A3、A4之間差異不顯著；B4萌發(fā)數(shù)最多，極顯著高于B1、B2和B3，B1和B3極顯著高于B2，B1與B3差異不顯著；C3萌發(fā)數(shù)最多，極顯著高于C1、C2和C4， C2極顯著高于C1和C4，C1與C4差異不顯著。因此，在以MS為基本培養(yǎng)基，促進(jìn)頂芽萌發(fā)的最優(yōu)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平組合為A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。

表3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)圓珠半夏頂芽塊莖萌發(fā)的促進(jìn)作用

注：K，各因素某一水平芽萌發(fā)數(shù)結(jié)果之和。

Note:Kindicates the sum of bud germination number of each factor at certain level.

2.2.2 愈傷組織 由表4可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 誘導(dǎo)愈傷組織形成的最優(yōu)水平分別為A3、B4和C3，即6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L、2,4-D 0.3 mg/L。經(jīng)方差分析表明，6-BA各濃度誘導(dǎo)帶頂芽塊莖形成愈傷組織塊數(shù)差異達(dá)顯著水平。NAA和2,4-D各濃度誘導(dǎo)帶頂芽塊莖形成愈傷組織塊數(shù)差異不顯著。經(jīng)多重比較表明，A3誘導(dǎo)的愈傷組織塊數(shù)最多，極顯著高于A1、A2和A4，A3、A4極顯著高于A1、A2，A2極顯著高于A1。NAA和2,4-D各水平誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)差異不顯著，最優(yōu)水平可選愈傷組織數(shù)最多的B4和C4。因此，以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)帶頂芽塊莖形成愈傷組織的最優(yōu)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平組合為A3B4C4，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L。

表4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)圓珠半夏帶頂芽塊莖形成的愈傷組織情況

注：K為各因素某一水平形成愈傷組織數(shù)之和。

Note:Kindicates the sum of callus number of each factor at certain level.

2.2.3 叢生芽 由表5可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 誘導(dǎo)帶頂芽塊莖形成叢生芽的最優(yōu)水平分別為A4、B4和C3，即6-BA 1.2 mg/L、NAA 0.3 mg/L、2,4-D 0.2 mg/L。經(jīng)方差分析表明，6-BA、NAA、2,4-D各濃度誘導(dǎo)叢生芽數(shù)差異達(dá)極顯著水平。經(jīng)多重比較表明，A4誘導(dǎo)叢生芽數(shù)最多，極顯著高于A1、A2、A3，A3極顯著高于A1、A2，A2極顯著高于A1；B4誘導(dǎo)叢生芽數(shù)最多，極顯著高于B1、B2和B3，B1極顯著高于B2和B3， B3極顯著高于B2；C3誘導(dǎo)叢生芽數(shù)最多，極顯著高于C1、C2和C4，C2極顯著高于C1和C2，C1與C4差異不顯著。表明，以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)叢生芽的最優(yōu)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平組合為A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。

表5 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)圓珠半夏帶頂芽外植體叢生芽的誘導(dǎo)效應(yīng)

注：K為各因素某一水平的從生芽數(shù)之和。

Note:Kindicates the sum of apical bud number of each factor at certain level.

3 結(jié)論與討論

半夏組織培養(yǎng)一般使用6-BA、NAA及2,4-D等調(diào)節(jié)劑經(jīng)過數(shù)次繼代完成[4-7]。試驗(yàn)表明，以圓珠半夏帶頂芽塊莖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，不同濃度的6-BA、NAA、2,4-D及其組合對(duì)頂芽萌發(fā)、愈傷組織和叢生芽誘導(dǎo)具有顯著或極顯著促進(jìn)作用。以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)圓珠半夏帶頂芽塊莖形成愈傷組織時(shí)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最優(yōu)水平組合為A3B4C4，即MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L。以MS為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)圓珠半夏帶頂芽塊莖頂芽萌發(fā)和叢生芽形成時(shí)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最優(yōu)水平組合為A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。半夏生產(chǎn)上多采用小塊莖、珠芽等方法進(jìn)行繁殖，但多代無性繁殖易受病毒侵染，而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[8-9]。試驗(yàn)以半夏帶頂芽塊莖為材料，對(duì)半夏組培快繁體進(jìn)行研究，為半夏塊莖組培苗生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。