狗棗獼猴桃鋅指蛋白(AkZFP2)的生物信息學(xué)分析

李然紅， 陳 鑫， 劉 丹， 王立鳳

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012)

狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕，別名狗棗子，常生于東北海拔800～1 500 m和四川海拔1 600～2 900 m山地混交林或雜木林中的開(kāi)曠地。狗棗獼猴桃是我國(guó)較為耐寒的野生果樹(shù)之一，葉色在紅、白、綠間變化，變化誘因有待進(jìn)一步研究，但極具觀賞性，同時(shí)果實(shí)和葉均可藥用，且狗棗獼猴桃是良好的蜜源植物[1-3]。鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFP)是一類(lèi)具有螺旋指狀結(jié)構(gòu)和 Zn2+結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，最早在非洲爪蟾中被發(fā)現(xiàn)[4]。根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸和組氨酸的數(shù)目和位置可分為C2H2、C4、C6、C4HC3、C2HC、CCCH等多種類(lèi)型[5]。鋅指蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)，如Q-type ZFP 可以參與植物的根系調(diào)控以響應(yīng)環(huán)境干旱[6]。ZFP參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、逆境脅迫應(yīng)答等功能[7]。SENDON等[8]研究表明，擬南芥中的Atdwa1鋅指C2H2蛋白能夠影響植株的開(kāi)花、葉片、矮小的生長(zhǎng)發(fā)育。OsMSR15在水稻的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段表現(xiàn)出對(duì)冷、熱、干旱脅迫具有正調(diào)節(jié)作用，并在種子萌發(fā)期對(duì)ABA有超敏感性[9]。ZFP能夠在低溫、干旱、鹽堿等脅迫環(huán)境中發(fā)揮重要作用，番茄、枳、煙草、大豆中的ZFP均在逆境環(huán)境中大量表達(dá)，巨桉的EgrZFP6能夠參與脅迫響應(yīng)的負(fù)調(diào)控，提高植物對(duì)低溫的敏感性[10-11]。目前，植物鋅指蛋白的研究已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，但有關(guān)狗棗獼猴桃基因組中鋅指蛋白基因的研究相對(duì)較少。因此，篩選鋅指蛋白的cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)狗棗獼猴桃鋅指蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能域、蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)及同源性等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以期探明ZFP在狗棗獼猴桃應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期低溫脅迫中發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

狗棗獼猴桃鋅指蛋白cDNA序列從牡丹江師范學(xué)院植物育種實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得；中華獼猴桃變種(PSS36210.1Actinidia chinensis var.chinensis)、罌粟(RZC69647.1 Papaver somniferum)、牛耳草(KZV33942.1 Dorcoceras hygrometricum)、野李變種(PQQ12403.1 Prunus yedoensis var.nudiflora)、漿果狀辣椒(PHT42171.1 Capsicum baccatum)、土瓶草(GAV59596.1 Cephalotus follicularis)、甜椒(XP_016579619.1 Capsicum annuum)、克萊門(mén)柚(XP_006453394.1 Citrus clementina)、蜜柑(GAY37133.1 Citrus unshiu)、蓖麻(XP_002534087.1 Ricinus communis)、陸地棉(XP_016698842.1 Gossypium hirsutum)、雷蒙德氏棉(XP_012474223.1 Gossypium raimondii)、海島棉(PPD80777.1 Gossypium barbadense)、葡萄(XP_010656831.1 Vitis vinifera)、榴蓮(XP_022732478.1 Durio zibethinus)、橡膠樹(shù)(XP_021655388.1 Hevea brasiliensis)等16種植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。

1.2 方法

AkZFP2的理化性質(zhì)用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)進(jìn)行分析；NCBI-CDD進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域及蛋白家族預(yù)測(cè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)； NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk /services/ NetNGlyc/)對(duì)N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)對(duì)O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用 SOPMA及PredictProtein 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.predictprotein.org/)對(duì)AkZFP2進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得16條不同植物的ZFP氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AkZFP2的理化性質(zhì)

經(jīng)分析表明，AkZFP2基因cDNA全長(zhǎng)為854 bp，編碼區(qū)(CDS)為cDNA上第185～619個(gè)堿基，共編碼145個(gè)氨基酸，分子量15 791.31 D，理論等電點(diǎn)為9.23，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為11，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為15，分子式為C682H1046N208O219S4，總原子數(shù)2 159，不穩(wěn)定指數(shù)(instability index,Ⅱ)為63.05，脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為55.24，親水性(GRAVY)的平均水平為-0.806。說(shuō)明該蛋白為親水非穩(wěn)定性蛋白。該蛋白中含量最多的為絲氨酸,占18.6%;含量最少的為纈氨酸，為0.7%(圖1)。通過(guò)ProtScale分析預(yù)測(cè)(圖2)，該基因蛋白的整個(gè)肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為0.544，在109個(gè)氨基酸處；最小值為-2.467，在第87個(gè)氨基酸處。從整體分布看，氨基酸的負(fù)值多且分值大，根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。

圖1 AkZFP2基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkZFP2 gene ofActinidiakolomikta

圖2 AkZFP2的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkZFP2

2.2 AkZFP2的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)

經(jīng)SignalP-4.0預(yù)測(cè)(圖3)，AkZFP2蛋白不含信號(hào)肽，同時(shí)不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

注：C值、S值和Y值分別是原始剪切位點(diǎn)、信號(hào)肽和綜合剪切位點(diǎn)的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

圖3 AkZFP2的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)

Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkZFP2

2.3 AkZFP2的結(jié)構(gòu)域

經(jīng)AkZFP2保守序列及蛋白家族進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)表明，AkZFP2是ZFP基因家族的ZF-C2H2-6成員(PFAM13912)。

2.4 AkZFP2的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)

經(jīng)對(duì)AkZFP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5)，該蛋白形成螺旋、延伸鏈、轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲的可能性分別為31.72%、13.10%、4.83%和50.34，無(wú)二硫鍵和特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL對(duì)AkZFP2蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(圖6)表明，該結(jié)構(gòu)主要構(gòu)件為無(wú)規(guī)卷曲和螺旋，在第38～73個(gè)氨基酸中含有鋅指C2H2結(jié)構(gòu)域。

圖4 AkZFP2的蛋白保守序列

圖5 AkZFP2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Fig.5 Secondary structure prediction of AkZFP2 protein

圖6 AkZFP2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

Fig.6 Tertiary structure prediction of AkZFP2 protein

2.5 AkZFP2的蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)

經(jīng)預(yù)測(cè)，該蛋白內(nèi)有1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，在第6個(gè)(NTSL)氨基酸處。經(jīng)對(duì)O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，分?jǐn)?shù)均>0.5預(yù)測(cè)是陽(yáng)性，該蛋白內(nèi)含20個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。由表1可見(jiàn)，AkZFP2含有1個(gè)鋅指C2H2型結(jié)構(gòu)域序列；2個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)十四烷?；稽c(diǎn)、1個(gè)酰胺化位點(diǎn)。

表1 AkZFP2蛋白的修飾位點(diǎn)

2.6 AkZFP2的氨基酸序列同源性

AkZFP2氨基酸序列與16種植物的ZFP序列進(jìn)行同源性比對(duì)(圖7)表明，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關(guān)系較近，而與羅布斯塔咖啡、蓖麻等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

鋅指蛋白是目前真核生物中分布最為廣泛的一類(lèi)蛋白，在植物抵抗逆境脅迫中扮演重要角色。C2H2型鋅指蛋白則是成員最多且研究較深入的一類(lèi)，并擁有高保守的結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)與特定基因的DNA結(jié)合或特異性互作，從而影響植物的抗性功能及生長(zhǎng)發(fā)育方面的調(diào)節(jié)[12]。目前已經(jīng)從多種植物包括擬南芥、大豆、小麥、水稻、矮牽牛等中克隆到ZFP基因，研究的相關(guān)材料多為草本植物，藤本植物的ZFP基因研究未見(jiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，ZFP基因在植物發(fā)育過(guò)程中起重要作用，擬南芥中ZFP基因缺失可導(dǎo)致植物腺毛數(shù)量下降，此外植物矮化、花枝退化都與ZFP基因相關(guān)[13-14]。ZFP基因其重要功能是與抗性相關(guān)，在干旱、鹽、冷、外源激素脅迫中均發(fā)揮作用[15]。狗棗獼猴桃是東北地區(qū)抗逆性較強(qiáng)的植物，研究其ZFP基因與抗逆性功能關(guān)系，為進(jìn)一步研究狗棗獼猴桃鋅指蛋白基因功能提供了理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明：AkZFP2基因cDNA全長(zhǎng)為854 bp，編碼蛋白由145個(gè)氨基酸構(gòu)成，不含跨膜結(jié)構(gòu)，絲氨酸含量較高，屬于ZF-C2H2-6蛋白家族(PFAM13912)，親水性非穩(wěn)定蛋白，結(jié)構(gòu)中含有QALGGH高保守結(jié)構(gòu)，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關(guān)系較近，而與蓖麻等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖7 ZFP系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

Fig.7 System phylogenetic tree of ZFP