長鏈非編碼RNA H19靶向miR-194-5p抑制LPS誘導心肌細胞炎癥反應

王少霞

(河南科技大學第三附屬醫(yī)院心內科，河南 洛陽 471003)

長鏈非編碼(Lnc)RNA是一類不同的非蛋白質編碼轉錄物，在各種生物過程中發(fā)揮重要作用〔1,2〕。由LncRNA調節(jié)的這些生物學過程包括侵襲、轉移、細胞凋亡、血管生成、microRNA沉默、胚胎發(fā)育、心臟衰老和腫瘤發(fā)展〔3～6〕。有研究報道，LncRNA UCA1通過抑制p27表達促進心肌細胞凋亡〔7〕。IncRNA H19是一種從H19基因轉錄的LncRNA，在胎兒的幾種組織中高表達，但出生后表達顯著降低〔8,9〕。有研究報道了H19相互矛盾的功能，特別是在癌癥中〔10～12〕。H19在細胞損傷中的作用研究有限，其在大鼠血管平滑肌細胞損傷后表達異常，但在心肌細胞損傷中的作用及機制尚未清楚。本研究擬以脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞H9c2為研究對象，檢測過表達H19、敲減miR-194-5p、過表達miR-194-5p對H9c2細胞炎癥因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1材料 心肌細胞H9c2購自ATCC；噻唑藍(MTT)、脂質體LipofectamineTM2000、逆轉錄試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)雙染色法凋亡檢測試劑盒購于Takara公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒、白細胞介素(IL)-6檢測試劑盒、IL-1β檢測試劑盒均購自北京萊寶公司。

1.2LPS誘導的心肌細胞損傷模型 參照龐斯斯〔13〕的方法進行改良，將心肌細胞H9c2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，待細胞融合度達80%時，將含有LPS(100 ng/ml)的DMEM 培養(yǎng)液處理24 h。

1.3細胞轉染 Control組：不做任何處理的H9c2細胞。LPS組：按照1.2方法處理的H9c2細胞。將pc-con、pc-H19、anti-miR-con、anti-miR-194-5p、pc-H19+miR-con、pc-H19+miR-194-5p按照脂質體LipofectamineTM2000轉染至H9c2細胞，然后按照1.2方法進行處理，分別標記為pc-con組、pc-H19組、anti-miR-con組、anti-miR-194-5p組、pc-H19+miR-con組、pc-H19+miR-194-5p組。將上述各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.4qRT-PCR實驗 取適量對數(shù)生長期1.3各組細胞，嚴格按照RNA抽提試劑盒說明書要求提取RNA，進行定量，然后按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書進行miR-194-5p、LncRNA H19檢測。用2-△△Ct計算miR-194-5p、LncRNA H19的表達。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 按照TNF-α、IL-6、IL-1β檢測試劑盒說明書檢測各組細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測實驗 熒光素酶報告載體(psiCHECK2-H19-WT,psiCHECK2-H19-MUT)分別與miR-194-5pmimics、miR-NC用脂質體法轉染24 h細胞，培養(yǎng)5 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉染48 h。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作步驟進行操作。結果以海腎熒光素酶的發(fā)光強度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強度的比值反映miR-194-5p與H19的結合力。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1LPS誘導心肌細胞中LncRNA H19和miR-194-5p的表達 與Control組(1.02±0.14、1.06±0.16)相比，LPS組心肌細胞中LncRNA H19表達(0.43±0.11)顯著降低，miR-194-5p表達(2.58±0.22)顯著升高(t=5.740、9.678，P=0.005、0.001)。

2.2LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6和 IL-1β的分泌 與Control組相比，LPS組心肌細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著升高(均P<0.05)，見表1。

2.3過表達LncRNA H19抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌 與pc-con組相比，pc-H19組心肌細胞中LncRNA H19表達顯著升高，TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著降低(均P<0.05)，見表2。

2.4敲減miR-194-5p抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌 與anti-miR-con組相比，anti-miR-194-5p組心肌細胞中miR-194-5p、TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著降低(均P<0.05)，見表3。

表1 LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌

表2 過表達LncRNA H19抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌

表3 敲減miR-194-5p抑制LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的分泌

2.5LncRNA H19靶向miR-194-5p 運用miRcode數(shù)據(jù)庫預測到miR-194-5p與H19存在結合位點(圖1)；雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-con組(0.98±0.09)相比，miR-194-5p組WT-H19細胞的熒光活性(0.31±0.04)顯著降低；與pcDNA組(1.00±0.09)相比，pcDNA-H19組細胞中miR-194-5p表達(0.36±0.05)顯著降低；與si-con組(0.94±0.11)相比，si-H19組(3.16±0.25)顯著升高(均P<0.05)，且4組差異有統(tǒng)計學意義(F=214.122,P=0.000)。

2.6過表達miR-194-5p逆轉了過表達LncRNA H19對LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用 與pc-con組(1.02±0.10)相比，pc-H19組心肌細胞中miR-194-5p表達(0.42±0.06)顯著降低(P<0.05)；與pc-H19+miR-con組相比，pc-H19+miR-194-5p組心肌細胞中miR-194-5p、TNF-α、IL-6、IL-1β表達均顯著升高(均P<0.05)。

見表4。

圖1 LncRNA H19中含有與miR-194-5p互補的核苷酸序列

表4 過表達miR-194-5p對LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用

3 討 論

研究表明，LncRNA 可作為一種競爭性的內源性 RNA 與非編碼miRNA交互作用，共同參與靶向基因的調控，對腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程產生重要影響〔14,15〕。同時，miRNA通過大量蛋白質編碼基因靶向調控LncRNA的表達，miRNA和LncRNA在調節(jié)細胞過程均有重要作用〔16〕。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA和miRNA在心肌缺血和再灌注(I/R)損傷的發(fā)病機制中起重要作用〔17,18〕。Gong等〔17〕發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導H9c2細胞活力、遷移和侵襲下降，細胞凋亡增加，H19上調，且敲低H19增加了H9c2細胞中的缺氧誘導的損傷，miR-139的表達與H19呈正相關，上調miR-139可加重缺氧誘導的損傷，另外，Sox8被鑒定為miR-139的靶標，其表達受miR-139的負調控，表明Sox8的過表達可能通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)來減少缺氧誘導的細胞損傷，提示H19通過miR-139介導的Sox8上調及PI3K/ AKT/ mTOR途徑和MAPK的激活來減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷。Luo等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，H19和miR-675在缺血再灌注的心肌細胞中上調，且敲除H19可增加細胞活力，減少細胞凋亡，減少炎癥細胞因子(IL-1β、TNF-α 和IL-6)，抑制氧化應激，下調p-IκB-α 和p-p65，并上調Nrf2和HO的表達，且miR-675的過表達可部分逆轉這些作用，此外過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α 是miR-675的靶基因，且H19通過miR-675負調節(jié)PPARα表達，抑制PPARα、miR-675或H19可部分逆轉對細胞功能(細胞凋亡、炎癥和氧化應激)的抑制作用，另外，在心肌I/R小鼠模型中，H19的敲低可明顯減少梗塞面積，增加左心室收縮壓，并降低左心室舒張末期壓力，表明抑制H19保護心臟免受心肌I/R損傷，其機制可能與調節(jié)miR-675/PPARα 通路有關。本研究發(fā)現(xiàn)，H19在損傷的H9c2細胞中低表達，且過表達H19可抑制H9c2細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19靶向負調控miR-194-5p。

miRNA參與很多疾病的發(fā)生發(fā)展，如肺損傷、心臟損傷及各種癌癥〔19〕。據(jù)調查miR-194-5p在肝癌、胃癌、腎癌、膠質瘤中均可發(fā)揮調控作用〔20～23〕。Xie等〔24〕報道，LPS處理的人成纖維細胞WI38可降低細胞活力，促進凋亡細胞，上調p-65、Bcl-3的表達，下調IκBα，且抑制miR-194可進一步增強LPS對細胞活力和細胞凋亡的影響，過表達miR-194可明顯逆轉LPS對細胞活力、細胞凋亡及關鍵蛋白p-65、Bcl-3、IκBα 的表達，揭示了miR-194通過抑制WI38細胞中核因子(NF)-κB途徑增加了LPS誘導的細胞活力抑制和細胞凋亡增加。Zhai等〔25〕報道，miR-194在LPS誘導的H9c2心肌細胞損傷模型中表達異常升高，且miR-194可靶向負調控Slc7a5，過表達Slc7a5可逆轉過表達miR-194對H9c2細胞的凋亡促進及激活Wnt/β-catenin通路作用，提示miR-194通過激活Wnt/β-catenin途徑促進心肌細胞凋亡并參與內毒素血癥誘導的心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-194-5p表達異常升高，與Xie等〔24〕研究結果一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，敲減miR-194-5p可抑制H9c2細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，過表達miR-194-5p可逆轉過表達H19對LPS誘導心肌細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、 IL-1β的抑制作用。

綜上，LncRNA H19可抑制LPS誘導的心肌細胞炎癥因子的分泌，其機制可能與靶向負調控miR-194-5p有關，為心肌損傷的治療提供理論依據(jù)。