miR-21可通過(guò)下調(diào)CCL20減輕心肌炎的炎性反應(yīng)抑制心肌細(xì)胞凋亡

李陽(yáng)春 張敏 雷蓉

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1心血管內(nèi)科，四川 南充 637000；2健康管理中心)

病毒性心肌炎(VMC)是由病毒侵襲心臟而引起心肌炎癥為主的心血管疾病〔1〕。該病可由多種病毒引起，其中有艾可(ECHO)病毒、柯薩奇病毒A組、柯薩奇病毒B組均可導(dǎo)致VMC，最常見(jiàn)的是由柯薩奇B組3型病毒(CVB3)引起的心肌病變，且其多發(fā)于青年和兒童〔2〕。病毒感染后會(huì)引起機(jī)體發(fā)生一系列的炎性反應(yīng)，激活機(jī)體凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)凋亡。該病的治療主要針對(duì)病毒感染和心肌炎癥。多數(shù)患者經(jīng)治療后可痊愈，但仍有部分患者會(huì)在急性期死亡。微小(mi)RNA為一類長(zhǎng)度在19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈小分子RNA，其表達(dá)具有組織特異性〔3〕。研究顯示，miRNA在病毒與宿主細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮重要用〔4〕。但miR-21在心肌炎細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。人巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(CCL20)為CC家族趨化因子中重要的成員之一，與其他趨化因子不同，其受體為趨化因子受體(CCR)6分子，主要分布在樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、效應(yīng)T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞和B細(xì)胞表面〔5〕。研究顯示，CCL20在VMC患者中高表達(dá)〔6，7〕，但其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究觀察過(guò)表達(dá)miR-21、沉默CCL20對(duì)心肌炎患者巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素(IL)-17及心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 健康志愿者、心肌炎患者心肌細(xì)胞、心肌炎患者巨噬細(xì)胞購(gòu)自ATCC；siNC、siCCL20、miR-21 mimics、pcDNA 3.1購(gòu)自索萊寶公司；CCL20定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇江萊公司；IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鈺博公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自吉滿生物。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)健康志愿者、VMC患者巨噬細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期用于實(shí)驗(yàn)；用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)健康志愿者、VMC患者心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，傳代培養(yǎng)，至第3～8代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將miR-21 mimimcs、miR-NC轉(zhuǎn)染至VMC患者巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞，標(biāo)記為miR-21 mimics組、miR-NC組，未做任何處理的VMC患者巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞標(biāo)記為NC組，siCCL20、siNC轉(zhuǎn)染至VMC患者巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞標(biāo)記為siCCL20組、siNC組，未做任何處理的VMC患者巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞標(biāo)記為NC組，將miR-21 mimics+pcDNA 3.1、miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20轉(zhuǎn)染至VMC患者心肌細(xì)胞，標(biāo)記為miR-21 mimics+pcDNA 3.1組、miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20組，以上各組均采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后備用。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.3各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞樣本總RNA，并定量。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書合成模板鏈cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書操作步驟要求進(jìn)行miR-21的測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束后分析Ct值，以2-△△Ct法計(jì)算定量結(jié)果，測(cè)定miR-21的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.5ELISA 按照CCL20定量檢測(cè)試劑盒、IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.3各組細(xì)胞中CCL20、IL-17的含量。

1.6Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 將1.3各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液500 μl懸浮，分別加入5 μl的 Annexin V-/ FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定結(jié)果：細(xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.7雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.3各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，以psiCHECK2-CCL20-3′非翻譯區(qū)(UTR)野生型(WT)和psiCHECK2-CCL20-3′UTR突變型(MUT)的表達(dá)為對(duì)照，觀察miR-21對(duì)CCL20表達(dá)的影響。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-21和CCL20在VMC患者中的表達(dá) 與健康志愿者相比，VMC患者心肌細(xì)胞中miR-21表達(dá)顯著降低(P<0.001)，血清中CCL20的含量顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 miR-21和CCL20在VMC患者中的表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)miR-21對(duì)VMC患者巨噬細(xì)胞中IL-17 與NC組、miR-NC組相比，miR-21 mimics組miR-21表達(dá)顯著升高，IL-17含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3沉默CCL20對(duì)VMC患者巨噬細(xì)胞IL-17水平及心肌細(xì)胞凋亡的影響 與NC組、siNC組相比，siCCL20組CCL20表達(dá)、IL-17水平、細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 過(guò)表達(dá)miR-21下調(diào)VMC患者巨噬細(xì)胞IL-17水平、心肌細(xì)胞凋亡

與NC組比較：1)P<0.05；與miR-NC組比較：2)P<0.05

表3 沉默CCL20下調(diào)VMC患者巨噬細(xì)胞IL-17水平、心肌細(xì)胞凋亡

與NC組比較：1)P<0.05；與siNC組比較：2)P<0.05

2.4CCL20是miR-21的靶基因 通過(guò)TargetScan對(duì)miR-21和CCL20進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-21和CCL20存在互補(bǔ)序列(圖1)。將CCL20-WT、CCL20-MUT轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，標(biāo)記為CCL20-WT組、CCL20-MUT組，未做任何處理的心肌細(xì)胞標(biāo)記為NC組。與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的CCL20-WT組心肌細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，CCL20是miR-21的靶基因。

圖1 CCL20的3′UTR中含有與miR-21互補(bǔ)的核苷酸序列

組別NCCCL20-WTCCL20-MUTmiR-NC組1.48±0.181.52±0.191.51±0.15miR-21 mimics組1.47±0.160.52±0.091.53±0.13t值0.0728.2390.175P值0.9460.0010.870

2.5過(guò)表達(dá)CCL20可逆轉(zhuǎn)miR-21對(duì)VMC患者心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用 與miR-NC組〔(9.24±0.67)%〕相比，miR-21 mimics組細(xì)胞凋亡率〔(4.12±0.39)%〕顯著降低(P<0.05)；與miR-21 mimics+pcDNA 3.1組〔(3.97±0.26)%〕相比，miR-21 mimics+pcDNA 3.1-CCL20組細(xì)胞凋亡率〔(9.17±0.74)%〕顯著升高(P<0.05)?？梢?jiàn)，過(guò)表達(dá)CCL20可逆轉(zhuǎn)miR-21對(duì)VMC患者心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。

3 討 論

miRNAs由一類小型非編碼RNA組成，可控制互補(bǔ)目標(biāo)信使RNA表達(dá)〔8〕。miRNA在進(jìn)化上高度保守，通過(guò)與靶基因3′UTR相結(jié)合從而抑制靶基因的翻譯或使其降解〔9〕。研究證實(shí)miRNA參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過(guò)程，與腫瘤、心臟等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在心肌肥厚、心肌纖維化、心律失常和心力衰竭中均具有重要作用〔10〕。Thum等〔11〕在衰竭心臟成纖維細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)miR-21高表達(dá)，且沉默miR-21可通過(guò)失活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAP)抑制間質(zhì)纖維化，減弱心臟功能，提示miR-21可作為心力衰竭疾病治療的靶點(diǎn)。何進(jìn)等〔12〕在心肌炎的研究中構(gòu)建CVB3誘導(dǎo)的VMC小鼠模型，并檢測(cè)模型小鼠心肌組織中10種miRNA的表達(dá)，揭示miR-92a、miR-126-5p、miR-199a、miR-210、miR-208表達(dá)上調(diào)，miR-21、miR-320表達(dá)下調(diào)，且這些異常表達(dá)的調(diào)控與心肌細(xì)胞周期、遷移、凋亡及血管生成均相關(guān)。本研究與前人研究結(jié)果相吻合，驗(yàn)證了miR-21可靶向結(jié)合CCL20，且過(guò)表達(dá)CCL20可逆轉(zhuǎn)miR-21對(duì)VMC患者心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。

心臟受病毒侵襲后會(huì)引起一系列的病理生理變化，如氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、炎性因子的分泌、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變等，甚至發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡、壞死〔13〕。心肌細(xì)胞為不可再生的終末分化細(xì)胞，因此在心臟病中可逆性的抑制心肌細(xì)胞凋亡將保護(hù)心肌細(xì)胞免受損，得益于心臟〔14〕。顏雯等〔15〕研究報(bào)道，在VMC中，心肌細(xì)胞的凋亡水平明顯升高，且雷米普利可抑制VMC中心肌細(xì)胞的凋亡，提示雷米普利可用于VMC的治療。本研究提示過(guò)表達(dá)miR-21、沉默CCL20對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

炎癥為機(jī)體損傷和抗損傷的統(tǒng)一過(guò)程，其中損傷因子(細(xì)菌、病毒等異物)可直接或間接造成組織和細(xì)胞的損傷，也可通過(guò)炎癥充血和滲出反應(yīng)，以稀釋、殺傷和包圍損傷因子〔16，17〕。IL-17 是由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生的致炎因子，其可激活T 細(xì)胞，刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、細(xì)胞黏附分子(CAM)-1，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生〔18，19〕。心肌炎患者最顯著的特征為心肌細(xì)胞中炎性因子分泌增加，嚴(yán)重者可至心肌壞死。Yuan等〔20〕在急性病毒性心肌炎的研究中構(gòu)建了CVB3誘導(dǎo)的BALB/c小鼠急性病毒性心肌炎(AVMC)模型發(fā)現(xiàn)，小鼠脾臟Th17細(xì)胞、血清IL-17、心臟IL-17 mRNA表達(dá)顯著升高，并伴有AVMC心臟損傷，IL-17可中和分泌抗病毒細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ的Th1和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)，上調(diào)脾Th1和CD8+T細(xì)胞和心臟IFN-γ mRNA水平，使病毒復(fù)制減少，心肌炎性細(xì)胞因子IL-17、TNF-α、IL-1β的含量均減少，揭示Th17細(xì)胞參與了AVMC中CVB3的復(fù)制，IL-17可能是調(diào)節(jié)抗病毒免疫平衡的重要靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-21、沉默CCL20均可下調(diào)心肌巨噬細(xì)胞中IL-17的含量。

綜上，miR-21可降低CCL20表達(dá)減輕心肌炎的炎性反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與靶向CCL20有關(guān)，為急性心肌炎的治療提供靶點(diǎn)。