一株海綿共附生真菌Fusarium equiseti SCSIO 41019的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其抑菌活性研究

陳春梅 羅小衛(wèi) 李坤龍 郭翠 李基興 林秀萍 劉永宏,*

(1 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

海綿是原始的多孔多細(xì)胞動(dòng)物，以過(guò)濾性捕食方式富集了大量的微生物[1]。作為海洋底棲生物，海綿的生長(zhǎng)環(huán)境具有高鹽、高壓、避光、缺氧、寡營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn)。海綿共附生真菌因受特殊生存環(huán)境的影響而含有豐富的沉默基因，可以形成獨(dú)特的生理代謝方式，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎且多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2-4]。另外，海綿結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏有效的物理防御系統(tǒng)，因此海綿共附生真菌在與宿主共同進(jìn)化過(guò)程中，為構(gòu)成強(qiáng)大的化學(xué)防御機(jī)制，保護(hù)宿主免受競(jìng)爭(zhēng)者、捕食者以及傳染性微生物的威脅，其次級(jí)代謝產(chǎn)物多具有顯著的生物活性[2]。目前，人們已從海綿共附生真菌中發(fā)現(xiàn)大量結(jié)構(gòu)新穎且生物活性顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括生物堿、聚酮、萜烯、甾體、環(huán)肽等，具有抗腫瘤、細(xì)胞毒活性、抗病毒、抗瘧原蟲(chóng)及抗菌等生物活性[5-6]。金黃色葡萄球菌是臨床常見(jiàn)感染的致病菌之一，具有分布廣泛、致病性強(qiáng)、耐藥率高等特點(diǎn)[7]。此外，MRSA廣泛流行，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥性強(qiáng)[8]。因此尋找新型治療MRSA感染的藥物意義重大。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物為伊快霉素(equisetin)，屬于tetramic acid化合物[9]。Tetramic acid是一類(lèi)以吡咯烷-2,4-二酮為母核的一類(lèi)生物堿，廣泛存在于天然產(chǎn)物中。從土壤真菌Fusariumsp.FN080326分離得到的(+)-fusarisetin A；從海綿Theonellasp.中分離得到的aurantosides A和B以及從雷公藤的內(nèi)生真菌CryptosporiopsisCF.quercina中分離得到的cryptocin等化合物都屬于此類(lèi)[10-12]。生物活性研究表明，部分tetramicacid化合物具有較好的抗腫瘤、抗病毒、抗?jié)儭⒊莺鸵志壬锘钚訹10]。本課題組多年來(lái)致力于海洋微生物來(lái)源活性先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與挖掘研究，對(duì)一株海綿來(lái)源真菌Fusarium equiseti進(jìn)行了次級(jí)代謝產(chǎn)物及其抑菌活性研究。從中分離獲得8個(gè)化合物(圖1)，通過(guò)波譜學(xué)方法分別鑒定為：equisetin(1)、5'-epiequisetin(2)、lumichrome(3)、N-乙?；?4)、亞油酸(5)、methyl(4-hydroxyphenyl)acetate(6)、methyl(2-hydroxyphenyl)acetate(7)和graminin B(8)。抑菌活性研究表明，化合物1、2和5對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA具有一定的抑制活性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

AVANCE 700核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；高效液相色譜儀(Hitachi公司)；中壓色譜儀(Buchi公司)；EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)郎儀器有限公司)；SHZ-CB型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；KQ-250DB型超聲儀(鞏義市予華儀器有限公司)；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療器械有限公司)；薄層硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)；硅膠H(青島海洋化學(xué)儀器廠)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)。提取分離所用試劑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等均為化學(xué)純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，液相色譜乙腈、甲醇為色譜純(美國(guó)Merck公司)。

1.2 菌株鑒定

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of compounds 1～8

菌株分離自廣東湛江徐聞縣采集的美麗屬海綿(Callyspongiasp.)的新鮮組織中，編號(hào)為SCSIO 41019，標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。菌株18S rDNA序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)定，將其ITS序列進(jìn)行BLAST分析，其與菌株Fusarium equisetiisolate JG22 (accession No.KJ412501.1)的ITS序列相似度高達(dá)100%。此外，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，最終將該菌株鑒定為Fusarium equiseti。其ITS序列如下：

CTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCA TTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAA CATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGC GCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGAC CCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTA AAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACG GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCA GCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG CCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAG CGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTG GGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATT GGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATC ATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACG CCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCG GATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGTCGGAGGAA

1.3 菌株發(fā)酵

采用大米培養(yǎng)基(大米125g，海鹽2g，蒸餾水150g，pH7.4)進(jìn)行發(fā)酵，在116℃下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后接種，共發(fā)酵48瓶，室溫靜止培養(yǎng)30d。

1.4 代謝產(chǎn)物的提取分離

菌株發(fā)酵結(jié)束后將大米搗碎，加入等體積乙酸乙酯，超聲20min，提取液經(jīng)濃縮后得棕紅色浸膏約50g。然后用100～200目硅膠拌樣，經(jīng)中壓柱色譜分離(石油醚/CH2Cl2, 100:0～0:100和CH2Cl2/CH3OH, 100:0～1:1)梯度洗脫后經(jīng)TLC檢識(shí)合并得8個(gè)流份。Fr.6經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(CH3CN/H2O, 10:90～100:0)分離得10個(gè)子流份，其中Fr.6-7再用半制備液相(CH3CN/H2O, 65:35)得到化合物1(58mg)和2(133mg)。Fr.2經(jīng)半制備液相(CH3CN/H2O, 77:23)得到化合物5(7mg)、6(67mg)和7(144mg)。Fr.8經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(CH3CN/H2O, 10:90～100:0)分離得5個(gè)子流份，F(xiàn)r.8-2用半制備液相(CH3OH/H2O, 32:68)得到化合物3(5mg)，4(5mg)和8(20mg)。

1.5 抑菌活性測(cè)定

1.5.1 濾紙片瓊脂擴(kuò)散法篩選抑菌活性化合物

將待測(cè)化合物配成濃度為10mg/mL的甲醇溶液，陽(yáng)性對(duì)照氨芐西林配成0.64mg/mL的甲醇溶液。分別用移液槍吸取10μL待測(cè)化合物溶液于直徑為6mm的無(wú)菌濾紙片上，待甲醇揮干后，將載樣濾紙片貼于已涂布100μL×106CFU/mL菌懸液的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉18g、海鹽10g、蒸餾水1L、pH7.4)上，25℃條件下倒置培養(yǎng)24h，每12h觀察一次是否產(chǎn)生抑菌圈。以氨芐西林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，甲醇作為陰性對(duì)照。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的SCSIO 41019與其他鐮刀菌屬部分代表菌株的Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on ITS sequences showing relationships between strain SCSIO 41019 and closely related members of genus Fusarium

1.5.2 改良肉湯稀釋法測(cè)定MIC值

對(duì)于活性篩選中顯示出抑菌活性的化合物，進(jìn)一步采用改良肉湯稀釋法測(cè)定MIC。用甲醇分別將待測(cè)化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥物溶解并配至濃度為5.000、2.500、1.250、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005mg/mL和1.250、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005、0.0025和0.0013mg/mL共11個(gè)濃度的稀釋液。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入20μL各濃度待測(cè)化合物、80μLLB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，海鹽10g，蒸餾水1L，pH7.4)和100μL×106CFU/mL菌懸液，平行3組。以氨芐西林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，甲醇作為陰性對(duì)照。25℃培養(yǎng)12～48h，每12h觀察各孔細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照觀察，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)孔中的最小濃度即為該化合物對(duì)病原菌的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：[α]25D=-260(c 0.10, CH3OH);1H NMR (700MHz, CD3OD)δH: 5.36～5.43(2H, m, H-4, H-5), 5.18～5.26(2H, m, H-13, H-14), 3.92(2H, qd,J=16.8, 3.5Hz, H-6'), 3.67(1H, br s, H-5'), 3.35(1H, m, H-3), 3.04(3H, s, H-7'), 2.01 (1H, brs, H-10a), 1.89～1.70 (4H, m, H-7, H-9), 1.52(3H, d,J=6.3Hz, H-15), 1.47(3H, s, H-12), 1.11 (2H, m, H-6, H-10b), 0.94(3H, d,J=9.1Hz, H-16), 0.87(1H, m, H-11);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 198.5(C, C-4'), 192.6(C, C-1), 177.9(C, C-2'), 132.3(CH, C-5/C-13), 131.1(CH, C-5/C-13), 127.9(CH, C-4/C-14), 127.8(CH, C-4/C-14), 102.2(C,C-3'), 69.3(CH, C-5'), 59.9(CH2, C-6'), 49.8(C, C-2), 46.4(CH, C-3), 43.6(CH2, C-7), 41.4(CH, C-11), 39.9(CH, C-6), 36.9(CH2, C-9), 34.8(CH, C-8), 29.4(CH2, C-10), 27.3(CH3, C-7'), 23.0(CH3, C-16), 18.1(CH3, C-15), 14.5(CH3, C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故將化合物1鑒定為equisetin。

化合物2：[α]25D=-105(c 0.10, CH3OH);1H NMR (700MHz, CD3OD)δH: 5.33～5.41(2H, m, H-4, H-5), 5.33(1H, m, H-13), 5.13(1H, brs, H-14), 3.93(2H, q,J=11.2Hz, H-6'), 3.69(1H, brs, H-5'), 3.35(1H, m, H-3), 3.04(3H, s, H-7'), 2.00(1H, brs, H-10a), 1.88～1.69(4H, m, H-7, H-9), 1.50(3H, d,J=6.3Hz, H-15), 1.48(3H, brs, H-12), 1.07～1.14(2H, m, H-6, H-10b), 0.94(3H, d,J=9.1Hz, H-16), 0.88(1H, m, H-11);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 198.3(C, C-4'), 192.1(C, C-1), 177.9(C, C-2'), 131.8(CH, C-5/C-13), 130.9(CH, C-5/C-13), 128.7(CH, C-4/C-14), 127.9(CH, C-4/C-14), 102.2(C, C-3'), 69.0(CH, C-5'), 59.3(CH2, C-6'), 49.9(C, C-2), 46.1(CH, C-3), 43.6(CH2, C-7), 41.3(CH, C-11), 39.9(CH, C-6), 36.9(CH2, C-9), 34.7(CH, C-8), 29.5(CH2, C-10), 27.3(CH3, C-7'), 23.0(CH3, C-16), 18.1(CH3, C-15), 14.8(CH3, C-12)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與化合物1相似，其中1H NMR中δH: 3.93(2H, q,J=11.2Hz, H-6')和13C NMR中δC: 69.0(CH, C-5'), 59.3(CH2, C-6')與化合物1有細(xì)微差別，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9,13]報(bào)道基本一致。因此鑒定化合物2為equisetin的差向異構(gòu)體5'-epiequisetin。

化合物3：1H NMR(700MHz, DMSO-d6)δH: 7.84(1H, s, H-6), 7.63(1H, s, H-9), 2.46(3H, s, H-11), 2.43(3H, s, H-12);13C NMR(175MHz, DMSO-d6)δC: 161.9(C, C-4), 152.5(C, C-2), 150.8(C, C-10a), 149.2(C, C-9a), 143.7(C, C-5a), 142.4(C, C-8), 137.8(C, C-7), 130.8(C, C-4a), 128.6(CH, C-6), 125.8(CH, C-9), 20.2(CH3, C-12), 19.6(CH3, C-11)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的lumichrome基本一致，故化合物3鑒定為lumichrome。

化合物4：1H NMR(700MHz,CD3OD)δH: 7.54(1H, d,J=7.7Hz, H-4), 7.32(1H, d,J=8.4Hz, H-1), 7.08(2H, m, H-3, H-7), 7.00(1H, td,J=7.7, 1.1Hz, H-2), 3.46(2H, t,J=7.4Hz, H-9), 2.93(2H, t,J=7.4Hz, H-10), 1.91(3H, s, H-12);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 173.3(C, C-11), 138.2(C, C-6), 128.8(C, C-5), 123.3(CH, C-7), 122.3(CH, C-2), 119.6(CH, C-3), 119.2(CH, C-4), 113.3(C, C-8), 112.2(CH, C-1), 41.6(CH2, C-10), 26.2(CH2, C-9), 22.6(CH3, C-12)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的N-乙?；?N-acetyltryptamine)基本一致，故化合物4鑒定為N-乙?；?。

化合物5：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 5.31～5.39(4H, m, H-9, H-10, H-12, H-13), 2.78(2H, t,J=7.0Hz, H-11), 2.26(2H, t,J=7.4Hz, H-2), 2.03～2.08(4H, m, H-8, H-14), 1.60(2H, m, H-3), 1.29～1.34(14H, m, H-4, H-5, H-6, H-7, H-15, H-16, H-17), 0.91(3H, q,J=7.0Hz, H-18);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 178.6(C, C-1), 130.9(CH, C-13, C-9), 129.1(CH, C-10, C-12), 35.6(CH2, C-2), 32.7(CH2, C-16), 30.7(CH2, C-7), 30.5(CH2, C-6), 30.3(CH2, C-5), 30.3(CH2, C-15), 30.2(CH2, C-4), 28.2(CH2, C-8), 28.1(CH2, C-14), 26.5(CH2, C-11), 26.3(CH2, C-3), 23.6(CH2, C-17), 14.4(CH3, C-18)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的亞油酸linoleic acid基本一致，故化合物5鑒定為亞油酸。

化合物6：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 7.06(2H, d,J=11.9Hz, H-2, H-6), 6.72(2H, d,J=11.9Hz, H-3, H-5), 3.64(3H, s, H-9), 3.51(2H, s, H-7);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 174.5(C, C-8), 157.5(C, C-4), 131.3(CH, C-2, C-6), 126.3(CH, C-3, C-5), 116.2(C, C-1), 52.4(CH3, C-9), 40.9(CH2, C-7)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的對(duì)羥基苯乙酸甲酯基本一致，故化合物6鑒定為對(duì)羥基苯乙酸甲酯(methyl(4-hydroxyphenyl)acetate)。

化合物7：1H NMR(700MHz, CD3OD)δH: 7.08(2H, m, H-4, H6), 6.76(2H, m, H-3, H-5), 3.67(3H, s, H-9), 3.60(2H, s, H-7);13C NMR(175MHz, CD3OD)δC: 174.7(C, C-8), 156.7(C, C-2), 132.0(CH, C-4), 129.4(CH, C-6), 122.5(C, C-1), 120.4(CH, C-5), 115.8(CH, C-3), 52.3(CH3, C-9), 36.4(CH2, C-7)。該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的鄰羥基苯乙酸甲酯基本一致，故化合物7鑒定為鄰羥基苯乙酸甲酯(methyl(2-hydroxyphenyl)acetate)。

2.2 化合物抑菌活性測(cè)定

濾紙片瓊脂擴(kuò)散法篩選抑菌活性化合物結(jié)果顯示(圖3)，化合物1、2、5對(duì)金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分別具有不同程度的抑制作用。改良肉湯稀釋法測(cè)定MIC值結(jié)果顯示(表1)，化合物1、2、5的最小抑菌濃度值為2.0～125μg/mL。

3 討論

圖3 化合物1、2、5和6(10mg/mL)對(duì)病原菌作用24h的抑菌效果Fig.3 Inhibitory effects of compounds 1～2 and 5～6 (10mg/mL) against pathogenic bacteria after 24h

表1 化合物1、2和5的最小抑菌濃度值Tab.1 The MIC values of compounds 1, 2 and 5

本文從海綿來(lái)源的共附生真菌Fusarium equisetiSCSIO 41019中共分離得到8個(gè)化合物，包括2個(gè)tetramic acid類(lèi)生物堿(1～2)、1個(gè)異咯嗪類(lèi)生物堿(3)、1個(gè)吲哚類(lèi)生物堿(4)和4個(gè)聚酮類(lèi)化合物(5～8)，并測(cè)試了其對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA的抑制活性，其中化合物1、2和5對(duì)受試病原菌具有一定的抑菌活性。據(jù)報(bào)道，equisetin(1)具有抑菌、細(xì)胞毒和抑制HIV病毒等生物活性，是抗HIV病毒感染的重要先導(dǎo)化合物之一[9,13,20]。本次抑菌活性結(jié)果表明equisetin(1)對(duì)金黃色葡萄球菌和耐MRSA具有強(qiáng)抑制活性，MIC值分別為2.0和3.9μg/mL，但是5'-epiequisetin(2)卻表現(xiàn)出中等抑菌活性，MIC值均為31.2μg/mL，說(shuō)明化合物1中5'S構(gòu)型有利于提高其抑菌活性。此外，脂肪酸類(lèi)化合物linoleic acid(5)在內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中較為常見(jiàn)且具有一定的抗菌活性，說(shuō)明其可以參與形成化學(xué)防御體系保護(hù)宿主免受侵害[21-23]。本研究豐富了該菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性，也為將equisetin類(lèi)化合物開(kāi)發(fā)為具有抑菌活性的先導(dǎo)化合物提供了一定的參考。