?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法

孫勛勛，楊宏宇，周軼楠，劉吉平

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】雙生病毒科（Geminiviridae）擁有400多種植物病毒，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，能夠侵染木瓜、棉花、豆類和蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Geminiviridae病毒為單鏈DNA病毒，有單組份和雙組份兩種，主要有菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）、玉米線條病毒屬（Mastrevirus）、甜菜曲頂病毒屬（Becurtovirus）、曲頂病毒屬（Curtovirus）、番茄偽曲頂病毒屬（Topocuvirus）、蕪菁曲頂病毒屬（Turncurtovirus）、畫眉草線條病毒屬（Eragrovirus）、冠狀病毒屬（Capulavirus）和葡萄藤紅斑病毒屬（Grablovirus）等9個屬，主要通過煙粉虱、葉蟬、樹虱和蚜蟲等昆蟲傳播［1］。?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒（Mulberry Mosaic Dwarf associated Virus，MMDaV）和橘褪綠矮縮相關(guān)病毒（Citrus Chlorotic Dwarf associated Virus，CCDaV）是兩種木本雙生病毒，具有獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)，但因未明確其媒介昆蟲和病毒粒子形態(tài)，所以將它們歸為未定屬［2］。?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒（MMDaV）是在皺縮和花葉狀的桑葉中發(fā)現(xiàn)，并未確定該病毒與桑花葉型萎縮病具有相關(guān)性［3］。?；ㄈ~型萎縮病主要導(dǎo)致桑樹植株矮化，葉片皺縮畸形并存在褪綠斑等癥狀，在我國各蠶區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重［4］。但是由于柯赫氏法則驗(yàn)證困難，至今還未能確定MMDaV與?；ㄈ~型萎縮病之間的關(guān)系。【前人研究進(jìn)展】對于雙生病毒CCDaV，已有實(shí)時(shí)熒光定量PCR［5］和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）［6］兩種檢測方法檢測CCDaV，可對CCDaV進(jìn)行快速定量和可視化的檢測。而針對MMDaV，雖然已建立了PCR［7］以及核酸斑點(diǎn)雜交（nucleic acid spot hybridization，NASH）檢測技術(shù)［8］檢測MMDaV，但這些方法無法對MMDaV進(jìn)行快速定量檢測?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】與PCR 相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量和快速等特點(diǎn)，在植物病害檢測上具有廣泛的應(yīng)用［9］。本研究以MMDaV保守的外殼蛋白基因序列為引物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，構(gòu)建有效的MMDaV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，并以廣東、廣西、海南、重慶、陜西和江西采集的桑病葉樣品為檢測對象，驗(yàn)證MMDaV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的有效性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】快速定量的檢測桑樹中的MMDaV，能進(jìn)一步用于桑樹、MMDaV和昆蟲三者間互作關(guān)系的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

帶有皺縮和花葉狀的桑病葉材料（圖1）采集于廣東、廣西、海南、重慶、陜西和江西等地，樣品信息見表1。桑葉污葉病病原真菌桑球針殼（Phyllactinia moricola）和桑葉常見真菌疣孢青霉（Penicillium verruculosum），桑椹菌核病病原真菌肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides），桑樹青枯病病原細(xì)菌茄科勞爾式菌（Ralstonia solanacearum），桑樹青枯病病原細(xì)菌假單胞菌（Pseudomonadaceaespp.）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacaesp.），家蠶微粒子病病原家蠶微孢子（Nosema bombycis）和家蠶白僵病病原真菌白僵菌（Beauveriabassiana）保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞太地區(qū)蠶桑培訓(xùn)中心微生物實(shí)驗(yàn)室。

圖1 ?；ㄈ~型萎縮病癥狀Fig.1 Symptom of mulberry mosaic dwarf disease

1.2 CTAB法抽提植物基因組DNA

在CTAB法提取植物DNA［10］的基礎(chǔ)上，為提高DNA的純度，在加入600 mL異丙醇后，將全部液體吸入核酸純化吸附柱套件中，12 000 r/min離心30 s過濾，棄濾液；加入70%乙醇500 μL洗滌，12 000 r/min離心30 s，棄濾液，洗滌2次，最后空離1次；將吸附柱放置于新的1.5 mL EP管中，加50 μL ddH2O，12 000 r/min離心30 s獲得桑葉總DNA。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

NCBI上獲得桑花葉型萎縮病相關(guān)病毒的全基因組序列（KP303687.1）為靶序列，篩選擴(kuò)增外殼蛋白基因序列引物MCP581F/MCP1464R，并以保守外殼蛋白基因?yàn)榘行蛄校O(shè)計(jì)特異實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物MCP981F/MCP1148R。MMDaV外殼蛋白基因的PCR檢測引物MCP746F/MCP1148R［7］用于對照，以上引物序列信息見表2。

表1 各地桑病葉樣品信息Table 1 Information of diseased mulberry leaf sample

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.4 構(gòu)建陽性質(zhì)粒

以皺縮和花葉狀的桑病葉總DNA為模板，使用引物MCP581F/MCP1464R擴(kuò)增包含病毒外殼蛋白基因序列。反應(yīng)體系（20 μL）：北京擎科生物科技有限公司金牌PCR Mix（TSE101） 10 μL，ddH2O 7 μL，桑病葉總DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR條件為98 ℃預(yù)變性30 s，98 ℃變性 8 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增目的條帶使用TaKaRa膠回收試劑盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit）純化，純化的片段使用北京全式金生物有限公司克隆試劑盒pEASYBlunt Cloning Kit（CB101）構(gòu)建陽性質(zhì)粒，使用生工SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（B518191-0050）提取質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度使用分光光度計(jì)檢測。將質(zhì)粒濃度計(jì)算成拷貝數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)公式：拷貝數(shù)=（6.02×1023×質(zhì)粒質(zhì)量）/（堿基數(shù)×660）。本實(shí)驗(yàn)以1.93×109copies/μL為初始濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物檢測

PCR特異性檢測以皺縮和花葉狀的桑病葉、桑球針殼（P.moricola）、肉阜狀杯盤菌（C.carunculoides）、白僵菌（B.bassiana）、疣孢青霉（P.verruculosum）、茄科勞爾式菌（R.solanacearum）、假單胞菌（P.spp.）、陰溝腸桿菌（E.cloacaesp.）、家蠶微孢子（N.bombycis）和健康桑葉總DNA為模板對引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。PCR靈敏度檢測將質(zhì)粒濃度從1.93×106copies/μL到1.93×101copies/μL以10倍稀釋作為模板進(jìn)行檢測。檢測引物反應(yīng)體系（20 μL）：2×TaqMaster Mix（Microanalysis Inc）10 μL，ddH2O 7 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增的片段經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測的DNA模板參照PCR檢測模板，其靈敏度檢測將陽性質(zhì)粒從1.93×105copies/μL 到 1.93×101copies/μL 濃 度以10倍梯度稀釋制成標(biāo)準(zhǔn)參照液，每個濃度重復(fù)檢測3次。反應(yīng)體系（20 μL），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201，東 洋 紡 生物有限公司）10 μL，ddH2O 7 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)。儀器為MYGOmini熒光定量PCR儀（3OY-XT4-7NN，IT-IS Life Science Ltd）。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建MMDaV陽性質(zhì)粒

擴(kuò)增獲得包含MMDaV外殼蛋白基因的序列，成功構(gòu)建MMDaV外殼蛋白基因克隆質(zhì)粒MCP14-pEASY-Blunt，質(zhì)粒中包含外殼蛋白基因長度為884bp，NCBI上blast僅對比到桑花葉型萎縮病相關(guān)病毒（KR131749.1），最大相似率為97.96%。

2.2 檢測引物PCR的特異性及靈敏性檢測

檢測引物MCP981F/MCP1148R的PCR特異性及靈敏度（圖2）。特異性檢測結(jié)果除了花葉皺縮狀的桑病葉總DNA及陽性質(zhì)粒存在大小為168 bp左右的目的條帶，其他參照樣品和陰性對照均無目的條帶，說明該引物的PCR特異性良好。靈敏度檢測結(jié)果質(zhì)粒濃度從1.93×106copies/μL到1.93×103copies/μL存在明顯條帶，其余泳道無條帶，說明該引物的PCR最低檢測限為1.93×103copies/μL。

圖2 引物特異性及靈敏性PCR檢測Fig.2 PCR detection for specificity and sensitivity of primers

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

成功構(gòu)建陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，從熒光曲線（圖3）可以看出，不同濃度之間存在明顯的梯度，且重復(fù)性良好。以質(zhì)粒濃度為橫坐標(biāo)，3次Cq平均值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），結(jié)果濃度與Cq值之間線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= -3.3739x+ 33.083，其 中R2= 0.9992，斜 率為 -3.3739，擴(kuò)增效率（E=10^（-1/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）-1）為97.88%。以Cq值≤30的作為檢測敏感區(qū)間，檢測的最低有效質(zhì)粒濃度為8 copies/μL。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測

對該引物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果（圖5）除了對陽性質(zhì)粒和花葉皺縮狀的桑病葉檢測出現(xiàn)曲線，其他樣品均未出現(xiàn)曲線，說明該引物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測上的特異性良好。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各地樣品

使用構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法對采集于廣東、廣西、海南、重慶、陜西和江西等6個省區(qū)花葉皺縮狀的桑病葉樣品進(jìn)行檢測。對比引物MCP746F/MCP1148R的PCR檢測與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果（圖6）PCR對各地桑病葉樣品檢測均有條帶，條帶強(qiáng)弱不一，實(shí)時(shí)熒光定量PCR對各地桑病葉樣品檢測 均有相應(yīng)的曲線（圖7），檢測的Cq值在9.69～26.17之間。并且實(shí)時(shí)熒光定量PCR與普通PCR電泳條帶強(qiáng)弱程度存在對應(yīng)的Cq值，普通PCR條帶亮度強(qiáng)的，其實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的Cq值越小，反之越大。說明實(shí)時(shí)熒光定量PCR對各地桑病葉樣品均具檢測結(jié)果，且檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠且可量化。

圖3 不同濃度質(zhì)粒的實(shí)時(shí)熒光定量PCRFig.3 The real-time fluorescence quantitative PCR for plasmids with different concentrations

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve

圖5 引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性驗(yàn)證Fig.5 Real-time fluorescence quantitative PCR for primer-specific detection

圖6 各地樣品PCR檢測電泳結(jié)果Fig.6 PCR detection results of samples from different provinces

3 討論

圖7 各地樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Fig.7 Real-time fluorescence quantitative PCR detection of samples from different provinces

實(shí)時(shí)熒光定量PCR比普通PCR和LAMP檢測技術(shù)的靈敏度高［11］，該技術(shù)可生產(chǎn)成診斷試劑盒［12］。在植物病毒檢測上，實(shí)時(shí)熒光定量PCR被廣泛應(yīng)用于我國產(chǎn)量最高的蘋果、梨、柑橘、葡萄和香蕉等5種果樹中病毒的檢測，其中病毒外殼蛋白基因?yàn)樽畛Ｓ玫臋z測靶標(biāo)［13］。本研究采用應(yīng)用最廣的非特性性染料SYBR Green I構(gòu)建MMDaV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以MMDaV外殼蛋白基因序列為靶序列。在驗(yàn)證植物病毒檢測引物的特異性時(shí)，大多數(shù)研究者使用以相同植物上的不同病毒作為參照［12-13］。目前已報(bào)道過多種桑樹病毒，但都未能明確與桑樹之間的關(guān)系，也不能穩(wěn)定的檢出，因此無法獲得其他桑樹病毒作為參照。因?yàn)樯渲饕脕眇B(yǎng)蠶、采桑葉和采桑椹，所以本實(shí)驗(yàn)以桑葉、桑椹和家蠶常見病原微生物作為對照檢測特異性也具有一定的實(shí)踐意義。

可重復(fù)性方面，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為97.88%，在90%～105%之間且接近1，說明重復(fù)性好。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9992，接近1，說明該檢測方法可靠性高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可用于檢測不同時(shí)期帶病植株和昆蟲體內(nèi)的病毒量［14-15］，本研究建立的MMDaV實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠定量的檢測MMDaV，該檢測方法最低有效質(zhì)粒檢測濃度為8 copie/μL，與凌薇等［14］構(gòu)建的櫻桃葉斑駁病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法有效質(zhì)粒檢測濃度為23 copies/μL均具有較高靈敏度，并且其靈敏度是MMDaV常規(guī)PCR的24倍［7］。

雖然?；ㄈ~型萎縮病在全國各大蠶區(qū)均有發(fā)生，但至今僅在江蘇鎮(zhèn)江［8］和陜西安康學(xué)院［16］兩地有MMDaV的報(bào)道，此次在廣東、廣西、海南、陜西、重慶和江西等地皺縮和花葉的桑病葉中均檢測到MMDaV，MMDaV的檢出地點(diǎn)增加。

4 結(jié)論

本研究建立的MMDaV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性和可定量等特點(diǎn)，可應(yīng)用于廣東、廣西、海南、陜西、重慶和江西等多個地方桑病葉MMDaV的定量檢測。