粗毛纖孔菌三萜的提取及膽酸鹽結(jié)合研究

劉爽爽，王昀睿，李德海

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

血脂異常是造成動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的重要因素?？刂蒲疆惓＃档腕w內(nèi)膽固醇的含量，可有效減少這些疾病的發(fā)生[1]。膽酸鹽是膽汁中由膽固醇衍生而來的具有甾核結(jié)構(gòu)的一類兩性大分子，可以通過對(duì)膽固醇和脂肪的消化吸收引起血脂水平升高。因此將膽酸鹽排出體外可降低膽酸鹽在肝腸循環(huán)過程中的積累，促進(jìn)膽固醇的代謝，達(dá)到降血脂的目的[2]。目前辛伐他汀是通過吸收膽酸鹽降低高血脂癥的一種有效合成藥物，但是長(zhǎng)時(shí)間服用會(huì)有損害肝腎、血糖升高等副作用[3]。因此，開發(fā)有效降低血脂的天然功能性成分藥物成為熱點(diǎn)。研究表明三萜類化合物是一類有較好降血脂作用的天然產(chǎn)物，具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景[4]。

粗毛纖孔菌Inonotus hispidus又名粗毛黃孔菌，是一種以寄生為主的藥用真菌，該菌在國(guó)內(nèi)主要分布于北京、河北、黑龍江等北溫帶地區(qū)，東北常見于水曲柳上，西北地區(qū)常見于桑樹。常被用來治療消化不良、癌癥、糖尿病等疾病[5]。研究表明，粗毛纖孔菌中含有多種抗腫瘤等疾病的天然成分，其中三萜類化合物就是一種重要的活性成分[6]。目前，關(guān)于提取方法對(duì)三萜類化合物提取率影響的研究已有報(bào)道。采用水浴法提取IHT，提取率可以達(dá)到4.59%[7]。采用雙水相超聲波法提取樺褐孔菌三萜，三萜提取率比常規(guī)超聲波法提高0.8%[8]。采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波法提取走馬胎總?cè)?，提取率可以達(dá)到6.88%[9]。同時(shí)還有報(bào)道不同提取方法對(duì)三萜類化合物提取率及功能的影響。李德海等[10]研究了不同提取技術(shù)對(duì)IHT 提取率及體外降血脂功能的影響，其中高剪切技術(shù)的三萜提取率及膽酸鹽結(jié)合量最大。但是關(guān)于提取方法過程中工藝參數(shù)對(duì)三萜類化合物降血脂活性影響的研究還鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)基于超聲波可以通過機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使溶劑迅速滲透到樣品組織細(xì)胞中，提高有效成分溶出速率，同時(shí)可以有效避免高溫造成的活性成分降解和功能下降的優(yōu)點(diǎn)和雙水相分離迅速、提取條件溫和、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[11,12]。以粗毛纖孔菌子實(shí)體為原材料，在體外模擬生物體內(nèi)環(huán)境，通過超聲波與雙水相技術(shù)聯(lián)用，研究了有機(jī)溶劑、有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)、鹽的種類、鹽濃度、料液比、超聲溫度、超聲功率和超聲時(shí)間8 個(gè)因素對(duì)IHT 提取率以及結(jié)合膽酸鹽能力的影響，以探尋利用超聲耦合雙水相提取技術(shù)提取IHT 及保留降血脂活性的最佳條件，為選擇IHT 的高效提取方法及開發(fā)新型降血脂藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

粗毛纖孔菌子實(shí)體：于2018年9月份在東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)的水曲柳上采摘粗毛纖孔菌子實(shí)體，將其體置于42 ℃烘箱中烘干，用小型粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩，收集篩下物，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑與設(shè)備

試劑：白樺脂醇，天津一方試劑有限公司；香草醛、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯，伊事達(dá)試劑公司；膽酸鈉、?；悄懰徕c，上海金穗生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 Biotopped 公司；所有試劑均為分析純，無需進(jìn)一步處理，直接使用。

設(shè)備：HY-200 標(biāo)準(zhǔn)篩（60 目），北京祥宇偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；KQ-300V 臺(tái)式超聲波清洗機(jī)，拓赫機(jī)電科技有限公司；DK-8D 電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司；722s 型紫外分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；IS-RSDS型臺(tái)式恒溫振蕩器，上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器公司。

1.2.2 超聲波輔助雙水相技術(shù)提取IHT 工藝的研究

準(zhǔn)確稱取粗毛纖孔菌子實(shí)體粉末3 g，按一定液料比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（mg∶mL））分別加入一定體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%、90%、100%）的溶劑（乙醚、乙醇、丙酮、異丙醇）和一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度（0.15 g/mL、0.20 g/mL、0.25 g/mL、0.30 g/mL、0.35 g/mL、0.40 g/mL）的鹽溶液（NaCl、Na2SO4、(NH4)2SO4）構(gòu)成雙水相體系，在一定超聲溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、超聲功率（150 W、180 W、210 W、240 W、270 W、300 W）、超聲時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）的條件下進(jìn)行超聲波耦合雙水相提取，超聲處理后在室溫浸泡2 h，然后于轉(zhuǎn)速4 800 r/min 條件下離心10 min，得到上清液，即為粗毛纖孔菌子實(shí)體三萜類化合物提取液。最后分別測(cè)定IHT 提取率和膽酸鹽的結(jié)合量，通過數(shù)據(jù)分析確定超聲波輔助雙水相技術(shù)提取IHT 工藝。

1.2.3 不同提取方法的比較

準(zhǔn)確稱取粗毛纖孔菌原料粉末3 g，分別用雙水相萃取法[8]溶劑法[13]、超聲輔助溶劑法[14]和高剪切輔助提取法[10]提取IHT，將提取得到的溶液按照上述方法測(cè)定IHT提取率和膽酸鹽的結(jié)合量。

1.2.4 IHT 提取率的測(cè)定

三萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]并稍作修改，準(zhǔn)確稱取白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，溶于50 mL 無水乙醇，混合得到標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL），吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，分別稀釋10、50、100、150、200、250、300 倍，吸取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，置于5 mL 容量瓶中，在100 ℃水浴蒸干后加入0.2 mL 新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL 高氯酸，搖勻后放入溫度為70 ℃的水浴鍋中反應(yīng)15 min 后，常溫下放置3～5 min，再加入乙酸乙酯定量到5 mL，搖勻，用不加樣品的溶液做空白對(duì)照，在551 nm 處測(cè)定吸光度（OD 值）。以白樺脂醇濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸線方程為y=0.009 1x+0.039 7（R2=0.995 7）

IHT 提取率的測(cè)定：吸取IHT 提取液1 mL 以80%丙酮定容至5 mL。然后吸取1.00 mL 至5 mL容量瓶中即得到待測(cè)液，按照上述方法測(cè)定吸光值，重復(fù)3 次，按照下列公式計(jì)算IHT 的提取率。

式中：V為提取液體積（mL）；C為提取液中IHT 的質(zhì)量濃度（mg/mL）；M為被測(cè)樣品的質(zhì)量（mg）；N為提取液的稀釋倍數(shù)。

1.2.5 膽酸鈉、牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

參考劉榮等[16]報(bào)道的方法并稍作修改，分別配制并移取不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)膽酸鹽溶液（膽酸鈉0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，?；悄懰徕c0.1、0.2、0.3、0.4、0.50 mmol/L）2 mL 于具塞試管中，加入6 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4溶液，在70 ℃下恒溫放置20 min，取出后冰浴5 min，在387 nm 處測(cè)定吸光值。以膽酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=1.102x+0.023，R2=0.9975，y=2.219 1x-0.001，R2=0.998 4。

1.2.6 膽酸鹽結(jié)合能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]稍作修改，取3 mL（40 mg/mL）樣品，依次加入3 mL（10 mg/mL）的胃蛋白酶，1 mL（0.01 mol/L）的HCl 溶液，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h 后，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值為6.3，然后再加入5 mL（10 mg/mL）胰酶，接著在37 ℃恒溫振蕩消化1 h。最后每個(gè)樣品中加入4 mL 膽酸鹽溶液（牛磺膽酸鈉濃度為0.5 mmol/L，膽酸鈉濃度為1 mmol/L）。在37 ℃恒溫水浴鍋中振蕩1 h 后，在4 000 r/min 下離心20 min，對(duì)上清液中的膽酸鹽進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算公式如下：

膽酸鈉結(jié)合量（μmol/100 mg）=膽酸鈉加入量-剩余量；

?；悄懰徕c結(jié)合量（μmol/100mg）=?；撬崮懰徕c加入量-剩余量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，以±s表示，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel 軟件，圖表均采用 Origin 9.0 處理完成，顯著性分析采用SPSS 21.0軟件，不同字母表示存在顯著性差異（P＜0.05），相同字母表示差異性不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波耦合雙水相提取IHT 條件的篩選及對(duì)膽酸鹽結(jié)合量的影響

2.1.1 有機(jī)溶劑對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

由圖1可知，4 種有機(jī)溶劑對(duì)IHT 提取效率和膽酸鹽結(jié)合量的影響有明顯地差異（P＜0.05），丙酮作為提取劑時(shí)IHT 提取率和膽酸鹽的結(jié)合最大，分別為提取率2.50%、膽酸鈉結(jié)合量0.58 μmol/100 mg、牛磺膽酸鈉結(jié)合量 0.33 μmol/100 mg。乙醚作為提取劑時(shí)IHT 提取率和膽酸鹽的結(jié)合量最小。結(jié)合相似相溶原理，可能是丙酮的極性與IHT 極性相近，其構(gòu)成的雙水相體系不僅有利于IHT 的溶解還可以增強(qiáng)IHT 在腸道內(nèi)與膽酸鹽結(jié)合的能力[18,19]，故選擇丙酮為有機(jī)溶劑。

圖1 有機(jī)溶劑種類對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.1 Effect of organic solvent type on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.2 有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

由圖2可知，丙酮的體積分?jǐn)?shù)在60～80%之間時(shí)，IHT 提取率隨丙酮體積分?jǐn)?shù)的增大而提高。在80～100%時(shí)，IHT 提取率隨丙酮體積分?jǐn)?shù)的增大而降低?？赡苁怯捎诒w積分?jǐn)?shù)的增大，提高了丙酮結(jié)合水分子的能力，下相中的水分子因競(jìng)爭(zhēng)吸附到上相中，提高了IHT 提取能力但隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)逐漸增加，樣品的水溶性成分在有機(jī)相中溶解性增加，抑制了三萜的溶出[20]。IHT 膽酸鹽結(jié)合量的變化趨勢(shì)與IHT 提取率一樣。三萜類化合物在體內(nèi)常與多糖等形成三萜皂苷，隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)的增加，溶劑對(duì)苷鍵的破壞能力增強(qiáng)，從而增加IHT 結(jié)合膽酸鹽的能力，但丙酮的體積分?jǐn)?shù)過高，溶劑的極性降低會(huì)影響極性較小的IHT 的化學(xué)結(jié)構(gòu)完整性，從而降低了IHT 結(jié)合膽酸鹽的能力[21]。故丙酮的最佳體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.1.3 鹽的種類對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

圖2 有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的 影響Fig.2 Effect of organic solvent volume fraction on IHT Extraction Rate and bile salt binding amount

圖3 鹽的種類對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.3 Effects of salt types on IHT extraction rate and bile salt binding amount

如圖3所示，當(dāng)鹽為硫酸銨時(shí)，IHT 提取率與膽酸鹽的結(jié)合量最大，分別為提取率3.52%、膽酸鈉結(jié)合量0.83 μmol/100 mg、?；悄懰徕c結(jié)合量0.59 μmol/100 mg，可能的原因是硫酸銨的銨根離子與水的氫氧根離子結(jié)合改變了提取液的pH 值，造成膽酸鹽的溶解性和陰離子化程度增大，膽酸鹽結(jié)合IHT 的基團(tuán)暴露，從而提高了膽酸鹽的結(jié)合量[22]。硫酸銨鹽析效應(yīng)可以在一定程度上提高和改善相分離能力，從而提高了硫酸銨的IHT 提取率[23]。雖然硫酸銨能提高IHT 提取率，但各種鹽對(duì)IHT 提取率無顯著性（P＞0.05）的影響，同時(shí)考慮到硫酸銨的價(jià)格相對(duì)便宜，容易購(gòu)買，可以減少試驗(yàn)中的支出，而且溶解度大不受溫度變化的影響。故鹽的種類選擇硫酸銨。

2.1.4 鹽濃度對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

由圖4可知，在0.15～0.20 g/mL 之間隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增大，三萜類化合物的提取率逐漸增大。隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加，硫酸銨與水的結(jié)合能力提高，丙酮的極性增大，三萜類化合物能更好的轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中[24]。硫酸銨質(zhì)量濃度在0.20～0.35 g/mL 之間時(shí)，IHT 提取率下降。由于雙水相形成的過程是丙酮和硫酸銨爭(zhēng)奪水分子的過程隨著鹽濃度的增加，頂相的體積減小，

圖4 鹽濃度對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.4 Effect of salt concentration on IHT extraction rate and bile salt binding amount

從而導(dǎo)致目標(biāo)化合物的減少[25]。在0.15～ 0.20 g/mL 之間膽酸鹽結(jié)合量隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增大而增大，硫酸銨質(zhì)量濃度超過0.20 g/mL時(shí)，膽酸鹽結(jié)合量隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增大而減少，可能是硫酸銨增加降低了提取液的pH 值，膽酸鹽的溶解性和陰離子化程度增大，膽酸鹽結(jié)合IHT 的基團(tuán)暴露，pH 值太低時(shí)雖然膽酸鹽的結(jié)合位點(diǎn)增多但I(xiàn)HT 較難以離子鍵的形式與膽酸鹽發(fā)生作用[22,26]。故選擇鹽濃度為0.20 g/mL。

2.1.5 料液比對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

由圖5可知，當(dāng)料液比在1∶3～1∶6 之間時(shí)，IHT 的提取率隨料液比的增大而增大， 1∶6 之后提取率趨于平緩。因?yàn)檩^高濃度的料液比不僅通過在內(nèi)部細(xì)胞和外部溶劑之間產(chǎn)生濃度差來提高提取效率，還有利于質(zhì)量傳遞。但是由于對(duì)傳質(zhì)的限制更多地局限于固體內(nèi)部，太多的液體增多也不會(huì)再改變驅(qū)動(dòng)力[27]。當(dāng)料液比在1∶3～ 1∶6 之間時(shí)，IHT 的膽酸鹽結(jié)合量隨料液比的增大而增大，1∶6 之后降低。這是因?yàn)殡S著溶劑的體積增加，超聲和微波介電分子也會(huì)增加，將導(dǎo)致IHT結(jié)合膽酸鹽的活性部分暴露，結(jié)合更加充分。但溶劑的體積太大就會(huì)導(dǎo)致超聲和微波介電分子太大，從而破壞IHT 的結(jié)構(gòu)[28,29]。故選擇料液比為1∶6。

圖5 料液比對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.6 超聲溫度對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

如圖6所示，當(dāng)超聲溫度在20 ℃～35 ℃之間時(shí)，IHT 的提取率隨溫度的增大而提高，溫度超過35 ℃，IHT 的提取率隨溫度的增加而降低。IHT 膽酸鹽結(jié)合量的變化趨勢(shì)與IHT 提取率一致?？赡苡捎跍囟鹊纳撸铀倭薎HT 分子的運(yùn)動(dòng)，增加了提取溶液對(duì)IHT 的傳導(dǎo)性使三萜類化合物的溶解更加完全，同時(shí)溫度升高也有利于IHT 結(jié)合膽酸鹽的活性部分暴露[30]。但溫度過高，不僅造成提取劑的揮發(fā),還可能造成IHT 結(jié)構(gòu)的破壞、分解、氧化[31]。故溫度選擇35 ℃為最佳。

圖6 超聲溫度對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.7 超聲功率對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

如圖7所示，當(dāng)超聲功率在150～240 W 之間時(shí)，IHT 提取率隨超聲功率的增大而提高，當(dāng)超聲功率在240～300 W 之間時(shí)，IHT 提取率隨超聲功率的增大反而降低。隨著超聲功率的增大提取液中會(huì)產(chǎn)生很多溫度高并且壓力大的汽泡，氣泡瞬間破裂時(shí)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波和高速射流，加速溶劑滲透到細(xì)胞組織內(nèi)通過破壞的細(xì)胞壁，將產(chǎn)物釋放到溶劑中[30]。IHT 膽酸鹽結(jié)合量的變化趨勢(shì)與IHT 提取率一致?？赡苁怯捎诔暪β实脑龃笫笽HT 結(jié)合膽酸鹽的活性部分暴露，結(jié)合更加充分，但超聲功率繼續(xù)增大，超聲的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)均增大就會(huì)造成IHT 結(jié)構(gòu)的破壞[29,32]。故超聲功率選擇240 W。

圖7 超聲功率對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.1.8 超聲時(shí)間對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

由圖8可知，超聲時(shí)間在20～40 min 之間時(shí)，IHT 提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。當(dāng)超聲時(shí)間在40～100 min 之間，IHT 提取率隨超聲時(shí)間的不斷延長(zhǎng)而降低。由于超聲波引起的空化效應(yīng)，使所有的細(xì)胞破裂，增大了溶劑和材料之間的接觸面積。超聲產(chǎn)生的空化微氣泡破裂時(shí)將促進(jìn)溶劑滲透到細(xì)胞中以溶解其中存在的大多數(shù)三萜，并且空化微氣泡數(shù)量隨著提取的持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[33]。但超聲時(shí)間過長(zhǎng)，超聲不僅將除三萜類化合物之外的其它雜質(zhì)溶出，超聲熱效應(yīng)還會(huì)引起溫度的升高使三萜類化合物分解[34]。IHT 膽酸鹽結(jié)合量的變化趨勢(shì)與IHT 提取率一致?？赡苁怯捎诔晻r(shí)間的延長(zhǎng)有利于IHT 活性部分暴露但當(dāng)繼續(xù)超聲時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的儀器工作產(chǎn)生的熱能會(huì)使溫度升高，致使三萜降解或是異構(gòu)化[30,35]。故選擇超聲時(shí)間為40 min。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)IHT 提取率及膽酸鹽結(jié)合量的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on IHT extraction rate and bile salt binding amount

2.2 不同提取方法對(duì)IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量的影響

由表1可知，超聲波耦合雙水相提取技術(shù)提取IHT 的提取率和膽酸鹽結(jié)合量均最大，其提取率為5.08±0.08%，膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結(jié)合量分別為1.49±0.12 μmol/100 mg、0.81±0.11 μmol/100 mg，其次是超聲波輔助溶劑法、高剪切輔助溶劑法和雙水相萃取法。溶劑法提取IHT 的提取率和膽酸鹽結(jié)合量均最小，其提取率僅為2.56±0.13 %，膽酸鈉和?；悄懰徕c結(jié)合量分別為0.62±0.04 μmol/100 mg、0.21±0.10 μmol/100 mg。由表看出不同的提取技術(shù)因提取原理的不同提取效果存在顯著差異（P＜0.05），超聲耦合雙水相提取法可以利用超聲波的空化效應(yīng)使活性成分溶出，且體系的溫度不會(huì)大幅度升高，不會(huì)破壞三萜分子結(jié)構(gòu)，從而提高了三萜的提取率及膽酸鹽結(jié)合量[36]。雙水相因分子間氫鍵、電荷相互作用、界面性質(zhì)等多種作用的影響，使三萜類化合物快速的從濃度差異大的兩相間分離出來，從而增大了三萜的提取率，使三萜類化合物與膽酸鹽的結(jié)合量增大[10]。超聲波輔助溶劑法縮短了溶劑提取法的提取時(shí)間，不僅提高了IHT 的提取率還避免IHT 因氧化喪失生物活性而降低三萜的膽酸鹽結(jié)合量[14]。高剪切輔助溶劑法利用高剪切轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的剪切力加速胞內(nèi)IHT 溶出的同時(shí)還能有效避免三萜因熱效應(yīng)發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，提高了三萜的提取率與膽酸鹽結(jié)合量[37]。溶劑法是對(duì)樣品加熱提取的一種方法，因提取時(shí)間長(zhǎng)，提取溫度高造成IHT 含量的損失和結(jié)構(gòu)的破壞，大大降低了三萜的提取率和膽酸鹽結(jié)合量[13]。因此超聲波耦合雙水相提取技術(shù)不僅可以提高三萜類化合物的提取率還有效保護(hù)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)使其具有良好的降血脂作用。

表1 不同提取方法的結(jié)果及比較?Table1 The results of different extraction methods and comparison

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以IHT 提取率和膽酸鹽結(jié)合量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)對(duì)超聲波耦合雙水相體系提取技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為：丙酮體積分?jǐn)?shù)80.0%、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度0.21 g/mL、料液比1:5，超聲功率240.0 W、超聲溫度35 ℃、超聲時(shí)間40 min，在此條件下IHT 的提取率為5.08%，膽酸鈉結(jié)合量為1.52 μmol/100 mg，牛磺膽酸鈉結(jié)合量為0.81 μmol/100 mg，與其它提取方法相比，超聲耦合雙水相體系提取IHT 不僅在操作方面上更為方便，時(shí)間短，提取率高，而且能更好的保護(hù)三萜的結(jié)構(gòu)使其具有良好的降血脂效果。因此超聲耦合雙水相體系提取技術(shù)具有較好的發(fā)展前景。

試驗(yàn)通過優(yōu)化超聲耦合雙水相萃取技術(shù)工藝參數(shù)提高了IHT的得率并改善了IHT的降脂功能，但對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)還有一段距離，因此關(guān)于IHT的實(shí)際生產(chǎn)仍需進(jìn)一步研究。此外關(guān)于提取方法過程中工藝條件對(duì)三萜類化合物結(jié)構(gòu)和降血脂功能關(guān)系的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。粗毛纖孔菌作為一種藥用真菌，對(duì)人體有保健作用，對(duì)疾病有治療、預(yù)防或抑制作用。因此，研究開發(fā)粗毛纖孔菌的功能成分尤其是IHT，對(duì)藥用真菌的研究利用具有重要意義。