杏RPW8基因家族鑒定與表達(dá)量分析

許靖詩，王廣軍，額爾敦達(dá)來，烏云塔娜

（1.北海市林業(yè)技術(shù)推廣站（林木種苗管理站）廣西 北海 536000；2.廣西北海濱海國家濕地公園管理處， 廣西 北海 536000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市巴林右旗巴彥塔拉蘇木政府林業(yè)站，內(nèi)蒙古 赤峰 024000； 4.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用 國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450003）

杏Armeniaca vulgaris屬于薔薇科Rosaceae 李亞科Prunoideae 杏屬Armeniaca 植物[1]。果肉不僅風(fēng)味甜美，且營養(yǎng)價(jià)值極高[2-4]。其果肉、果仁、核殼被廣泛應(yīng)用，是食品、藥品、化妝品、工業(yè)等行業(yè)的重要原料[5-8]。然而，近年隨著氣候的變化，白粉病也成為杏的重要病害，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)。

白粉?。≒owdery mildew）為寄生型真菌病害，是由真菌中的白粉菌Erysiphaceae 引起的，在自然界較為常見[9]。白粉菌屬于子囊菌綱，菌絲體直接暴露于寄主植物的芽、葉、莖、花蕾、花及果實(shí)的表面，并產(chǎn)生由菌絲體、分生孢子和分生孢子梗聚集成的白色粉狀物，因而稱為白粉病[10]。感染白粉病的作物的產(chǎn)量會(huì)降低，品質(zhì)也會(huì)受到嚴(yán)重影響[11-12]。白粉病對(duì)葡萄[13]、草莓[14]、芒果[15]等果品造成嚴(yán)重影響。我國已報(bào)道的白粉菌屬種類已多達(dá)約500種，危害約10 000種不同植物物種[16]。

RPW8是一個(gè)廣譜抗病基因，在擬南芥中含有兩個(gè)緊密連鎖的基因RPW8.1和RPW8.2[10]。研究發(fā)現(xiàn)RPW8基因不僅能對(duì)擬南芥白粉病產(chǎn)生抗性，同時(shí)還對(duì)擬南芥霜霉病、煙草白粉病和煙草花葉病等多種植物病害表現(xiàn)出較高的抗性[17-19]。為了更深入了解并應(yīng)用RPW8基因在不同植物中的功能，前人也進(jìn)行了較多研究。余力[20]將擬南芥廣譜坑病基因RPW8.1導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜，證明RPW8.1基因?qū)λ咕谟筒私M織細(xì)胞中的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用。而蘭宇[21]將RPW8.1基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯栽培種“大西洋”中，發(fā)現(xiàn)不能產(chǎn)生相應(yīng)抗性。孫金巧[22]發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜中RPW8同源基因具有類似于擬南芥中RPW8基因的部分功能，有部分基因具有抗白粉菌的功能。侯鳳娟[23]對(duì)RPW8.2轉(zhuǎn)基因葡萄進(jìn)行了生物學(xué)特性觀察及白粉病抗性評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)自然感病情況下轉(zhuǎn)基因葡萄對(duì)白粉菌抗性強(qiáng)于野生型植株。馬輝[24]利用同源克隆技術(shù)從葡萄中克隆得到了RPW8.2的同源基因，發(fā)現(xiàn)同不同葡萄組織中均有表達(dá)但是表達(dá)豐度不盡相同。除RPW8基因功能研究之外，Xiao、Eckardt 等[25-27]對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行了一定研究。隨著研究的不斷深入，植物RPW8基因的功能及抗病機(jī)理被逐漸認(rèn)識(shí)，但該家族基因在杏中研究卻鮮見報(bào)道。本文以杏全基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，鑒定RPW8家族成員，分析核酸序列的特征、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等信息，明確杏RPW8家族基因在不同組織中的表達(dá)特征，有利于更加深入了解RPW8基因家族功能，同時(shí)也為杏抗白粉病基因挖掘和抗白粉病育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

杏的不同組織器官樣品采摘自河北省張家口、內(nèi)蒙古赤峰杏資源圃，品種為龍王帽。取樣完成后，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 RPW8 基因家族成員鑒定

杏樹基因組、蛋白序列和CDS 序列由中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心提供，上述數(shù)據(jù)主要通過DNA 提取、PacBio 建庫測(cè)序、從頭組裝及注釋獲得，數(shù)據(jù)尚未公布。梨樹Pyrus pyrifolia、桃樹Prunus persica蛋白序列下載自薔薇科基因組在線數(shù)據(jù)資源GDR（GENOME DATABASE FOR ROSACEAE，https://www.rosaceae.org/）。擬南介Arabidopsis thaliana、楊樹Populus L.的基因組蛋白質(zhì)序列從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站下載。RPW8基因家族的隱馬爾科夫模型PF05659 下載于pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/），使用hmmsearch（版本號(hào)：3.1b2）程序比對(duì)到下載好的蛋白序列，設(shè)置參數(shù)--cut_ga，通過TBtool 提取目標(biāo)序列。

1.3 杏RPW8 基因家族的生物信息學(xué)分析

利用在線分析軟件SMS（Sequence manipulation suite，http://www.bioinformatics.org/sms2/dna_stats.html）對(duì)RPW8基因家族16 個(gè)基因的核酸特征進(jìn)行分析；利用在線軟件ProParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析RPW8基因家族氨基酸的理化性質(zhì)；通過GSDS2.0 在線軟件（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)RPW8基 因 家 族16 條 基因的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用MEME 在線軟件（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)杏RPW8 蛋白motif 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，設(shè)置motif 數(shù)量為10；利用MAGA6.0 構(gòu)建杏、梨、桃子、擬南介、楊樹RPW8基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹。首先利用Align 進(jìn)行序列對(duì)比，再使用Phylogeny 中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù) BootStrap 重復(fù)為1 000 次，其他參數(shù)均為默認(rèn)值；通過軟件TBtool 對(duì)杏RPW8基因家族的16 條基因在不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析

1.4 杏RPW8 基因家族表達(dá)量的計(jì)算

杏不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主要通過RNA 提取、Illumina 建庫測(cè)序，測(cè)序讀長為雙末端150 bp。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，通過FPKM法計(jì)算出每個(gè)基因在不同組織中的表達(dá)量，數(shù)據(jù)由中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心提供，且尚未公布。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏RPW8 基因家族的核酸序列的基本分析

從杏基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定到16 個(gè)RPW8家族基因，命名為LWMRPW8-1—LWMRPW8-16。利用SMS 對(duì)RPW8基因的核苷酸序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果顯示16 個(gè)基因的序列長度差異較大，其中LWMRPW8-2、LWMRPW8-4、LWMRPW8-6、LWMRPW8-9、LWMRPW8-10、LWMRPW8-12、LWMRPW8-15的序列較長，全長為3 131—7 429 bp，而LWMRPW8-3、LWMRPW8-8、LWMRPW8-11、LWMRPW8-13、LWMRPW8-16的序列較短，全長為360～894 bp。堿基對(duì)的比例之間相差較小，其中基因LWMRPW8-6的堿基G+C 含量最低為37.39%，而堿基A+T 的含量最高為62.61%?；騆WMRPW8-11的堿基G+C 含量最高為46.89%，而堿基A+T 的含量最低為53.11%。

表1 基因家族的核酸分析Table1 A comparison nucleic acid sequences of RPW8 gene family

2.2 杏RPW8 基因家族編碼的氨基酸

對(duì)RPW8基因家族編碼的氨基酸的理化性質(zhì)進(jìn)行分析（表2），結(jié)果表明相對(duì)分子量最小的是LWMRPW8-10，為13 653.93 Da，相對(duì)分子量最大的是LWMRPW8-15，為92 617.92 Da；理論 等 電 點(diǎn) 范 圍 為5.42～9.47；LWMRPW8-9帶的負(fù)電荷氨基酸數(shù)量最高為113，LWMRPW8-13和LWMRPW8-16帶的負(fù)電荷氨基酸數(shù)量最低均為17，LWMRPW8-4帶的正電荷氨基酸數(shù)量最高為109，LWMRPW8-10帶的正電荷氨基酸數(shù)量最低為18 個(gè)；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性指數(shù)范圍為22.94～61.18，其中LWMRPW8-16的不穩(wěn)定性指數(shù)最低，而LWMRPW8-10的不穩(wěn)定性指數(shù)最高；脂類結(jié)合蛋白質(zhì)指數(shù)介于85.21～124.08 之間，其中LWMRPW8-13的脂類結(jié)合蛋白質(zhì)指數(shù)最低，LWMRPW8-8的脂類結(jié)合蛋白質(zhì)指數(shù)最高。RPW8基因家族編碼的氨基酸組成成分以亮氨酸（Leu）賴氨酸（Lys）為主。

表2 RPW8 基因家族氨基酸序列的組成成分及理化性質(zhì)分析Table2 A comparison of composition,physical and chemical characters of amino acid sequence of RPW8 gene family

2.3 杏RPW8 基因結(jié)構(gòu)分析

通過GSDS2.0 在線分析，結(jié)果表明杏RPW8家族基因結(jié)構(gòu)內(nèi)含子數(shù)量小于6 個(gè)，外顯子為1～7 個(gè)（圖1）。基因LWMRPW8-16含有1 個(gè)內(nèi) 含 子；基 因LWMRPW8-1、LWMRPW8-2含 有2 個(gè)內(nèi)含子；基因LWMRPW8-12含有3 個(gè)內(nèi)含子；有4 個(gè) 基 因（LWMRPW8-4、LWMRPW8-7、LWMRPW8-9、LWMRPW8-15） 含 有4 個(gè) 內(nèi) 含子，基因LWMRPW8-6所含內(nèi)含子最多，為6個(gè)；有7 個(gè) 基 因（LWMRPW8-3、LWMRPW8-5、

LWMRPW8-8、LWMRPW8-10、LWMRPW8-11、LWMRPW8-13、LWMRPW8-14）無內(nèi)含子，僅含有1 個(gè)外顯子數(shù)。LWMRPW8-16含有2 個(gè)外顯子；LWMRPW8-1和LWMRPW8-2含 有3 個(gè) 外 顯 子；LWMRPW8-7、LWMRPW8-9、LWMRPW8-12含有4個(gè)外顯子；LWMRPW8-4、LWMRPW8-15含有5 個(gè)外顯子；LWMRPW8-6的外顯數(shù)含量最多，為7 個(gè)。

2.4 杏RPW8 保守結(jié)構(gòu)域蛋白分析

利用MEME 在線工具對(duì)杏RPW8 保守結(jié)構(gòu)域蛋白分析，由圖2可知，RPW8 蛋白共找到10 個(gè)保守基序。Motif9（E-value 為1.3e-064）在16 條基因中均存在，而Motif 4（E-value 為2.0e-055）僅在5 條基因中出現(xiàn)。Motif 1（E-value 為7.0e-103）、Motif 3（E-value 為1.4e-064）、Motif 5（E-value 為6.0e-080）在6 條基因中出現(xiàn)。Motif 2（E-value 為3.1e-091）在9 條基因中存在，Motif10（E-value 為5.6e-042）出現(xiàn)在11 個(gè)基因中出現(xiàn)，Motif 7（E-value為9.1e-055）在13 條基因中出現(xiàn)，Motif 8（E-value為2.3e-129）在14 個(gè)基因中出現(xiàn)。

2.5 RPW8 家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

圖1 山杏RPW8 基因結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of RPW8 gene in Apricot

利用MAGA6.0 構(gòu)建杏、梨、桃、擬南介、楊樹RPW8基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，RPW8基因家族可以分為兩類，薔薇科的杏、梨、桃RPW8家族基因聚為一類，擬南芥和楊樹RPW8家族基因聚為一類（圖3）。杏16 個(gè)RPW8基因之間遺傳距離為2～23，LWMRPW8-5與LWMRPW8-11之間遺傳距離最近，LWMRPW8-7與LWMRPW8-11之間遺傳距離最遠(yuǎn)。LWMRPW8-7與杏中其他家族成員及桃、梨RPW8家族成員遺傳距離較遠(yuǎn)，而與楊樹、擬南芥RPW8基因較近，因而聚為一類。經(jīng)多序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)LWMRPW8-7與杏RPW8基因家族其余成員的同源性較低為20%～47%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。LWMRPW8-7與其中6 條基因同源性為20%～29%，與其中8 條基因同源性為30%～39%，與其中1 條基因同源性為47%。

2.6 杏RPW8 基因在不同組織中的表達(dá)分析

通過對(duì)杏RPW8基因在不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，16 個(gè)基因在花、花芽、葉片、果肉、果仁中的表達(dá)呈現(xiàn)較大差異，在相同組織中不同基因表達(dá)量不一樣，在不同組織中同一基因表達(dá)量也不同（圖4）。4 個(gè)基因（LWMRPW8-9、LWMRPW8-4、LWMRPW8-10、LWMRPW8-12）在不同器官中表達(dá)量較高，其中LWMRPW8-9在葉片中表達(dá)量最高，達(dá)到27.28FPKM。而LWMRPW8-11、LWMRPW8-7、LWMRPW8-6、LWMRPW8-2、LWMRPW8-1、LWMRPW8-15僅在花芽中有一定表達(dá)，而在花、葉片、果仁、果肉中表達(dá)量較低，甚至不表達(dá)。LWMRPW8-8、LWMRPW8-5、LWMRPW8-3、LWMRPW8-16、LWMRPW8-13、LWMRPW8-14在各個(gè)器官中不表達(dá)。以上結(jié)果表明杏RPW8基因具有較高的組織表達(dá)特征，部分同源基因功能可能發(fā)生分化。

3 結(jié)論與討論

本研究基于杏基因組，鑒定出杏的16 個(gè)RPW8家族成員，基因全長為360～4 864 bp，杏RPW8基因家族編碼的氨基酸分子量為13 653.93～92 617.92 Da，理論等電點(diǎn)為5.42～9.47，不穩(wěn)定性指數(shù)為22.94～61.18，氨基酸組成成分以亮氨酸、賴氨酸為主。杏RPW8基因結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)杏內(nèi)含子數(shù)量小于6 個(gè)，外顯子為1～7 個(gè)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)杏RPW8家族主要含有10 個(gè)Motify，其中Motif8、Motif9 為特征結(jié)構(gòu)域；杏、梨、桃、擬南介、楊樹RPW8基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以分為兩類，薔薇科植物RPW8家族基因聚為一類，LWMRPW8-7與擬南芥、楊樹基因聚為一類。

圖2 RPW8 蛋白質(zhì)保守基序分布Fig.2 Distribution of conserved motifs in RPW8 Proteins

續(xù)圖2 RPW8 蛋白質(zhì)保守基序分布Continuation of fig.2 Distribution of conserved motifs in RPW8 proteins

圖3 杏、梨、桃、擬南芥、楊樹RPW8 蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of RPW8 proteins in apricot,Pear,peach,arabidopsis,poplar

目前RPW8基因家族的分析還比較少，從家族成員數(shù)量上來看，杏中共鑒定出16 個(gè)家族成員，大于擬南芥（6 個(gè)）、油菜（7 個(gè)）、桃子（12 個(gè)）、梨（12 個(gè)）。據(jù)此推斷，RPW8家族的成員數(shù)量在杏上得到了擴(kuò)展。

對(duì)于RPW8基因功能研究較多，已經(jīng)在多種植物中進(jìn)行了分析，對(duì)于其抗病機(jī)理也進(jìn)行了一定研究。Wang 等[28]發(fā)現(xiàn)RPW8.2中蘇氨酸、纈氨酸、天冬氨酸在對(duì)抗白粉病抗性中至關(guān)重要，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)賴氨酸或精氨酸富集區(qū)域與N末端跨膜域一起構(gòu)成了RPW8.2定位于吸器外質(zhì)膜的靶向信號(hào)。杏RPW8家族基因以亮氨酸（Leu）賴氨酸（Lys）為主，說明在抗白粉病中能起到一定作用。

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)RPW8家族基因內(nèi)含子數(shù)量小于6，基因LWMRPW8-3、LWMRPW8-5、LWMRPW8-8、LWMRPW8-10、LWMRPW8-11、LWMRPW8-13、LWMRPW8-14無內(nèi)含子僅含有1個(gè)外顯子數(shù)，說明杏 RPW8 家族成員基因容易受外界環(huán)境干擾。

聚類分析中LWMRPW8-7與其他杏RPW8家族成員同源性較低，分析發(fā)現(xiàn)LWMRPW8-7位于1 號(hào)染色體，大部分基因（LWMRPW8-1、LWMRPW8-2、LWMRPW8-3、LWMRPW8-6、LWMRPW8-8、LWMRPW8-9、LWMRPW8-12、LWMRPW8-13、LWMRPW8-15、LWMRPW8-16）位于7號(hào)；4個(gè)基因（LWMRPW8-5、LWMRPW8-10、LWMRPW8-11、LWMRPW8-14）位于5 號(hào)染色體，LWMRPW8-13位于4號(hào)染色體。

圖4 杏RPW8 基因在不同組織中表達(dá)Fig.4 Expression profile of RPW8 gene in Apricot

有研究發(fā)現(xiàn)，RPW8介導(dǎo)的白粉菌抗性受到環(huán)境異質(zhì)性的影響[29-31]。生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)杏在河南的白粉病發(fā)病率明顯高于內(nèi)蒙，特別是行間距較小情況下更易染病，因而在杏種植過程中選擇適合的行間距，保證通風(fēng)條件良好、避免形成高溫高濕的小環(huán)境。

對(duì)杏RPW8基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示16 個(gè)基因在花、花芽、葉片、果肉、果仁中的表達(dá)呈現(xiàn)較大差異，說明杏RPW8基因具有較高的組織表達(dá)特征，部分同源基因功能可能發(fā)生分化。研究結(jié)果為RPW8基因功能研究及抗白粉病基因挖掘和抗白粉病育種提供理論基礎(chǔ)。下一步將對(duì)杏RPW8基因家族的功能進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)研究。