三種殺菌劑對葡萄酒品質的影響及其消減規(guī)律

邢世均，石玲，劉廣娟，周燁，龔彩霞，王子榮

(新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院， 新疆 烏魯木齊，830000)

新疆光熱資源豐富，晝夜溫差大，有利于葡萄的生長。據(jù) 2018 年統(tǒng)計，新疆葡萄種植面積約 14.4萬公頃，年產量約 270.6 萬t[1]。葡萄種植過程中，病害時有發(fā)生，新疆葡萄病害主要有霜霉病、白粉病和炭疽病等[2]。為減少經濟損失，常使用化學殺菌劑預防和治療病害，由于管理缺乏規(guī)范，甚至出現(xiàn)過量使用和濫用的情況，導致葡萄殺菌劑殘留，通過釀造過程轉移到葡萄酒中，給葡萄酒質量安全帶來隱患。

農藥殘留，一方面可能會對消費者造成損害，另一方面也會影響葡萄酒的釀造過程。葡萄酒加工過程大體可以分為3個階段：酒精發(fā)酵(AF)，蘋果酸-乳酸發(fā)酵(MLF)，陳釀。BRIZCID等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在AF過程中一些殺菌劑會抑制或刺激酵母菌的活動，進而影響酒精發(fā)酵過程，甚至產生某些有害代謝產物或異味物質，對葡萄酒品質和感官質量造成影響；李記明等[4]發(fā)現(xiàn)一定濃度的農藥會改變AF發(fā)酵過程，同時造成感官質量明顯下降。RUEDIGER等[5]在研究農藥對MLF的影響時發(fā)現(xiàn)，農藥在一定程度上也會影響乳酸菌活性，改變MLF進程，影響葡萄酒品質。

CABRAS等[6]提出發(fā)酵過程中農藥與酵母是相互作用的。一方面，農藥影響發(fā)酵的活動；另一方面，發(fā)酵也能降低農藥殘留。農藥會在葡萄酒釀造過中被皮渣、酒泥及澄清劑吸附，使得殘留量降低，不同程度的降解，不同種類農藥在固體相(酒泥和皮渣)與葡萄酒兩相中的分布差異較大[7-8]。OLIVA等[9]發(fā)現(xiàn)在下膠澄清過程中使用不同澄清劑可以有效去某些農藥。綜上所述，農藥會對葡萄酒品質和感官質量造成影響，釀造過程中農藥殘留量也會降低，但不同農藥對葡萄酒品質影響程度或變化規(guī)律有差異。

目前，國內外對葡萄或葡萄酒農藥殘留研究較多的主要是農藥殘留的檢測手段和降解規(guī)律[10]。國內研究殺菌劑對葡萄酒品質的影響則較少。本文以“赤霞珠”葡萄為原料，研究生產中常使用的3種廣譜殺菌劑(嘧菌酯、甲基硫菌靈、甲霜靈)對葡萄酒釀造過程、品質及感官質量的影響，同時檢測釀造過程中3種農藥含量的變化規(guī)律。目的是為釀酒葡萄殺菌劑的使用提供相應理論指導，為葡萄酒農藥殘留安全性標準的制定提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 葡萄品種

試驗葡萄品種為有機“赤霞珠”，2018 年 9月 13 日在“國菲酒莊”采摘，選取生長周期相近(可溶性固形物(22±0.5)%)、無機械損傷和病蟲害的葡萄，散去田間熱后及時運回。

1.2 儀器與試劑

UV-1700紫外/可見分光光度計，上海美析儀器有限公司；UPHE-Ⅲ-90T超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司；R1001-VN旋轉蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿有限公司；3H16RI智能高速冷凍離心機，湖南赫西儀器設備有限公司；FE22 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；LE204E/02萬分之一天平，特勒-托利多儀器有限公司；TQS micro液相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；Sun FIreTMC18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，美國Waters公司。

甲基硫菌靈、甲霜靈、嘧菌酯、多菌靈標準品:阿爾塔科技有限公司；QuEChERS萃取鹽包：上海島津；甲醇、甲酸、乙腈(色譜純):天津光復；釀酒酵母(Zymaflore F15)、乳酸菌:法國LAFFORT公司；其他未列出試劑均為分析純。

1.3 處理方法

1.3.1 農藥添加

參照GB 2763—2016[11]，將其允許最高農藥殘留量作為農藥添加量，即甲基硫菌靈 5 mg/kg、甲霜靈2 mg/kg、嘧菌酯 2 mg/kg，以不添加農藥為對照。

1.3.2 葡萄酒釀造工藝

葡萄原料除梗破碎、添加農藥后裝入 20 L玻璃罐，加入60 mg/L SO2，浸漬 12 h，添加活化后的酵母啟動發(fā)酵，酒精發(fā)酵溫度控制在 25～30 ℃，比重降至 1.015 時，分離皮渣，添加乳酸菌后繼續(xù)發(fā)酵至比重 0.992～0.996，添加50 mg/L SO2，終止發(fā)酵，倒罐澄清，隨后葡萄酒在 10 ℃下滿罐密封貯藏。試驗酒樣設2次重復。

1.4 理化指標的測定

殘?zhí)?、酒精度、pH、總酸的測定參照GB/T 15038—2006[12]葡萄酒、果酒通用分析方法；總酚的測定參照CLIFF等[13]的方法；花色苷的測定采用pH示差法[14]；色度和色調、總單寧、鹽酸指數(shù)、乙醇指數(shù)的測定參照彭傳濤等[15]的方法。

1.5 感官評價

感官品嘗小組成員由 15 名接受過專業(yè)感官培訓的人員組成。評價小組分別從外觀(顏色 10 分，澄清度 5分)、香氣(濃度 10 分，質量10分，濃郁度 15 分)、口感(風味濃郁度 15 分，余味 15 分，平衡感 20 分)3個方面對葡萄酒進行比較品嘗，總分為 100 分。使用 5分結構化數(shù)值尺度來量化，0～4表示感覺強烈程度逐漸增大。

1.6 農藥含量測定

嘧菌酯含量測定參照吳延燦等[16]的方法，甲霜靈含量測定參照徐娟等[17]的方法，GB 2763—2016 規(guī)定甲基硫菌靈的殘留定義為甲基硫菌靈和多菌靈的殘留總和，以多菌靈計。甲基硫菌靈、多菌靈含量測定參照王昕璐等[18]的方法，4 種農藥標準曲線方程、線性范圍和相關系數(shù)見表1。4種農藥的相關系數(shù)R2均>0.99，表明4種農藥峰面積在線性范圍內與相對應的質量濃度呈現(xiàn)出良好的線性關系。

表1 標準曲線方程Table 1 Standard Curve Equations

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 和SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)分析，利用Duncan多項式進行差異顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著。使用Sigma Plot 14.0 繪圖。

2 結果與分析

2.1 農藥對葡萄酒AF進程的影響

如圖1，隨著葡萄酒發(fā)酵的進行，各處理組葡萄醪發(fā)酵溫度整體上呈先上升后下降趨勢，發(fā)酵前 24 h，溫度上升速度較快。在整個發(fā)酵過程中，甲基硫菌靈和甲霜靈處理的葡萄醪溫度變化過程與CK組相比較差異不顯著，添加嘧菌酯的葡萄醪發(fā)酵溫度整體上低于CK組(P<0.05)。隨著AF發(fā)酵的進行，各組比重呈現(xiàn)下降趨勢，甲基硫菌靈和甲霜靈比重下降速度與CK組差異不顯著，發(fā)酵進行 48 h后，嘧菌酯處理后的葡萄醪比重均高于同期各處理組(P<0.05)，推遲了AF約24 h，延長了葡萄酒AF過程。

a-溫度;b-比重圖1 農藥對發(fā)酵醪的影響Fig.1 Effects of pesticides on fermentation mash of wine

2.2 農藥對葡萄酒品質的影響

殘?zhí)?、總酸和酒精的含量與比例是影響葡萄酒品質的重要因素，葡萄酒顏色是葡萄酒重要的感官特征，單寧和花色苷等多酚是葡萄酒顏色主要的呈色和穩(wěn)定物質[19]，同時單寧還能賦予葡萄酒澀味和厚重感[20]，鹽酸指數(shù)和乙醇指數(shù)分別表示與多糖結合單寧比例和高聚合度單寧比例[21]。

由表2可看出，3種殺菌劑在不同程度上影響了葡萄酒的理化指標，不同殺菌劑對葡萄酒品質的影響不同。與CK相比，甲霜靈顯著降低了葡萄酒的色調、單寧、花色苷含量和鹽酸指數(shù)，同時顯著提高了殘?zhí)呛?P<0.05)，其中對鹽酸指數(shù)影響最大，鹽酸指數(shù)降低了25.63%。甲基硫菌靈對葡萄酒的色度、色調、總酚、花色苷的影響達到了顯著水平(P<0.05)，說明甲基硫菌靈對葡萄酒的顏色影響較大。嘧菌酯對葡萄酒品質影響最大，顯著提高了葡萄酒殘?zhí)?34.62%)、總酸(22.26%)、降低了酒精度(8.46%)、色度(3.25%)、總酚(5.88%)、單寧(8.78%)、花色苷(4.90%)、鹽酸指數(shù)(15.42%)和乙醇指數(shù)(0.52%)(P<0.05)。

表2 農藥對葡萄酒品質的影響Table 2 Effects of pesticides on wine quality

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 農藥對葡萄酒感官質量的影響

由圖2可看出，不同殺菌劑對不同感官指標的影響存在差異，3種殺菌劑對葡萄酒澄清度和色澤的影響較小，但3種農藥在不同程度上影響了葡萄酒的香氣和風味，其中甲基硫菌靈顯著降低了香氣質量、濃度和純正度(P<0.05)，嘧菌酯對葡萄酒理化指標影響較大，感官評價發(fā)現(xiàn)該農藥顯著降低了葡萄酒的平衡感和風味濃郁度(P<0.05)，而甲霜靈對葡萄酒感官品質影響較小。

圖2 農藥對葡萄酒感官質量的影響Fig.2 Effects of pesticides on sensory quality of wine

2.4 農藥在釀造過程中的消減

由表3可看出，在葡萄釀造過程中3種農藥含量均顯著降低，但3種農藥降解率在不同相和不同階段中不同。陳釀 3個月后，3種農藥在液體相均有明顯的降解(62.30%～82.98%)，平均為 73.79%，但降解程度會隨著農藥種類不同有所差異，說明3種農藥在葡萄酒中最終殘留量會顯著低于葡萄。本次試驗同時測定了葡萄酒釀造3個階段(AF、MLF、陳釀)對農藥的降解作用。結果表明，AF對農藥降解作用最為明顯(43.98%～64.54%)，平均為 52.44%，而MLF(平均 40.74%)和陳釀(平均 11.16%)對農藥降解作用較弱，即AF>MLF>陳釀。對AF結束液體相(酒)和固體相(皮渣)進行比較，發(fā)現(xiàn)不同農藥在兩相中的分配系數(shù)差異很大，嘧菌酯固液分配系數(shù)為 1.79∶1，甲基硫菌靈為1.43∶1，甲霜靈固液分配系數(shù)為 1.41∶1，說明皮渣可以對嘧菌酯有很強的吸附作用，甲基硫菌靈次之，甲霜靈最弱，不同農藥固液分配率不同。對MLF結束固液分配系數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn)嘧菌酯(4.51∶1)>甲基硫菌靈(2.11∶1)>甲霜靈(1.75∶1)，說明皮渣對嘧菌酯吸附作用最強。總體來看，皮渣或酒泥對不同農藥吸附作用不同。

表3 農藥在葡萄酒不同相中的分布Table 3 Distribution of pesticides in different phases of wine

注：降解率/%=(初始農藥含量-目標農藥含量)×100/初始農藥含量?！?”表示未檢出。

3 討論

殺菌劑對葡萄酒釀過程造會產生一定的影響，農藥可以通過影響酵母的繁殖或代謝過程來改變葡萄酒AF進程[22]。農藥殘留對葡萄酒釀造的影響會因農藥種類、劑量和酵母種類而異。本研究發(fā)現(xiàn)嘧菌酯能延緩酒精發(fā)酵過程，造成殘?zhí)?、總酸含量升高，酒精度含量下?P<0.05)。這與李記明等[4]、MULERO等[23]的研究結果相似。嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，可以抑制呼吸鏈中電子傳遞過程，進而抑制糖酵解作用，延長AF進程。同時，嘧菌酯顯著降低了乙醇指數(shù)、鹽酸指數(shù)以及葡萄酒的平衡感和風味濃郁度。甲基硫菌靈主要對葡萄酒香氣質量和風味影響較大，這可能是由于其分子中的含硫基團和亞氨基在釀造過程中轉化為異味物質的結果。甲霜靈對釀造過程和品質影響相對較小。本次試驗發(fā)現(xiàn)3種農藥均對葡萄酒感官品質造成了不良影響，這說明農藥改變了酵母的代謝過程，并產生了某些不良的代謝產物，這與NOGUEROLPATO等[24]、GARCIA等[25]研究農藥對感官品質和香氣物質的影響結果相似。

葡萄酒發(fā)酵后其農藥殘留的種類和含量不同程度的減少或降低，其主要原因是皮渣和酒泥對農藥的吸附作用[26]。本試驗發(fā)現(xiàn)，3種農藥經AF、MLF及陳釀后，其含量平均減少70%以上，說明經發(fā)酵后葡萄酒農藥含量會顯著低于葡萄，這與DOULIA等[27]研究結果一致。對比3個階段農藥降解率，發(fā)現(xiàn)AF階段是農藥降解或降低最快階段，結合AF后農藥在固液分配情況，發(fā)現(xiàn)皮渣吸附嘧菌酯附作用最強，多菌靈次之，甲霜靈最弱，這可能與其極性弱，水溶性差的特點有關。嘧菌酯(6 mg/L、20 ℃)溶解度遠小于甲霜靈(8.4 g/L、20 ℃)。NAVARRO等[28]和DANAE等[27]也認為農藥在葡萄破碎后的去除程度和農藥的溶解度有很大關系，溶解度越低，極性越弱，去除程度越大，這與本試驗結果一致。

農藥殘留和發(fā)酵過程相互影響，農藥殘留會影響發(fā)酵進程，發(fā)酵過程也會降低農藥殘留，二者相互作用效果會因農藥種類、葡萄品種、釀造工藝等改變而變[29]。CUS等[8]認為帶皮浸漬比去皮發(fā)酵更有利于農藥去除，DOULIA等[30]研究不同澄清劑對農藥吸附作用時發(fā)現(xiàn)，活性炭、蛋清等澄清劑可以去除農藥殘留，且農藥水溶性越弱越容易去除。綜上所述，在實際生產中選擇水溶性弱農藥，結合適當?shù)陌l(fā)酵工藝，有助于農藥殘留的去除。

4 結論

3種農藥在不同程度上改變了葡萄酒的發(fā)酵進程，降低了葡萄酒的品質和感官質量。發(fā)酵過程會顯著降低農藥含量，不同發(fā)酵階段對農藥的降解作用不同，AF>MLF>陳釀。固相(皮渣、酒泥)對溶解度越低、極性越弱的農藥吸附作用較強，此類農藥容易去除。