徽州呈坎羅氏毛豆腐營養(yǎng)成分及浸提液抗氧化活性的研究

胡曉倩,李長江,吳永祥,祁路路,王玉芹,黃輝,韓婷婷

1 (黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,安徽 黃山, 245041) 2 (黃山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,安徽 黃山, 245041)

徽州呈坎羅氏毛豆腐是原產(chǎn)地保護(hù)的著名大豆發(fā)酵食品，“呈坎羅氏”是其自主品牌商標(biāo)，入選非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，是“世博會”指定產(chǎn)品和“舌尖上的中國”報(bào)道產(chǎn)品，是不添加任何添加劑及防腐劑的綠色、獨(dú)特、地方性和傳承性的產(chǎn)品。

過量自由基能引發(fā)組織細(xì)胞病變，組織細(xì)胞病變可引起各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老，通過阻斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減少或消除自由基，可預(yù)防或減少疾病的發(fā)生，且具有防癌、抗癌的作用[1]。體內(nèi)過剩自由基能夠被具有抗氧化活性的物質(zhì)有效的清除，對具有抗氧化活性功能的食品的研究極具現(xiàn)實(shí)意義。

目前學(xué)術(shù)界對于毛豆腐的研究主要集中在毛豆腐發(fā)酵技術(shù)與化學(xué)成分的分析[2]，對毛豆腐的抗氧化功能研究甚少。本實(shí)驗(yàn)通過對非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐基本營養(yǎng)成分的檢測、浸提液的制備及其體外抗氧化活性(總還原力及對自由基清除能力)的測定，旨在為非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐功能機(jī)制研究及功能產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料

非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐，由安徽省黃山市呈坎羅氏毛豆腐工作坊提供。普通毛豆腐1和普通毛豆腐2，購自安徽省黃山市陽湖菜市場的兩家不同商家。

1.1.2 試劑

乙醇、甲醇、磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH 8.2)、鄰苯三酚、HCl、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Vc、過硫酸鉀等，均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TDL-5臺式低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠; HH-S恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器有限公司; YP3001N電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司; pH酸度計(jì),梅特勒-托利多儀器上海有限公司; SX4-10箱式電阻爐,上海樹立儀器儀表有限公司; LPCD-E3000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司; FL-1電子萬用爐,北京市永光醫(yī)療儀器有限公司; Microfuge 20R臺式高速冷凍離心機(jī),貝克曼庫爾特商貿(mào)中國有限公司; SpectraMax-190型全波長酶標(biāo)儀,美國Moleculear Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛豆腐營養(yǎng)成分檢測

呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐，同時(shí)進(jìn)行以下營養(yǎng)成分指標(biāo)的檢測，以示比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平行測定3次取平均值。

(1)pH值測定

pH酸度計(jì)測定。

(2)水分測定

按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分測定的標(biāo)準(zhǔn)和方法(GB/T 5009.3—2010)進(jìn)行測定[3]。

(3)灰分的測定

按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分測定的標(biāo)準(zhǔn)和方法(GB/T 5009.4—2016)進(jìn)行測定[4]。

(4)蛋白質(zhì)含量的測定

用BCA法蛋白含量測定試劑盒進(jìn)行測定。

(5)可溶性總糖含量的測定

采用蒽酮比色法測定[5]。以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖含量X為橫坐標(biāo)，A620為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=2.123 7X-0.001 2，R2=0.994 1，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在10～80 μg/mL時(shí)與A620呈良好的線性關(guān)系。將待測樣品溶液測得的吸光值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液的含糖量，并換算為100 g毛豆腐樣品中的總糖含量表示(g/100 g)。

(6)Vc含量的測定

采用2，4-二硝基苯肼比色法測定[6]。以標(biāo)準(zhǔn)品Vc含量X為橫坐標(biāo)，A500為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=0.011 3X-0.0013，R2=0.996 7， Vc標(biāo)準(zhǔn)品在1.6～8 μg/mL時(shí)與A500呈良好的線性關(guān)系。將待測樣品溶液測得的吸光值代入Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液的Vc含量,并換算為100 g毛豆腐樣品中的Vc含量，mg表示(mg/100 g)。

1.2.2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液單因素設(shè)置和制備

將呈坎羅氏毛豆腐研磨成糊狀，精準(zhǔn)稱取5、10、 20 g置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水作為溶劑，攪拌均勻后靜置60 min，得單因素料液比的1∶20、1∶10、 1∶5三個(gè)水平；再在單因素浸提溫度的35 ℃(接近體溫)和100 ℃(接近烹飪的蒸煮溫度)這2個(gè)水平的恒溫水浴鍋中浸提60 min，室溫下靜置冷卻至室溫，2 000 r/min離心15 min，再在4 ℃, 14 000 r/min離心30 min，取上清液為浸提液，置4 ℃冷藏備用。每個(gè)水平的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的可溶性固形物含量測定

采用干燥法測定[7]。選取干燥稱量容器，稱重后將重量記為W0。加入1 mL浸提液(按照1.2.2制備)，稱重后記為W1。90 ℃烘30 min，然后將烘箱溫度調(diào)為105 ℃，烘1.5 h后拿出，再放入干燥器中干燥30 min，稱重后記為W2(一定要達(dá)到恒重，即質(zhì)量差值小于0.2 mg)。每個(gè)水平浸提液均平行做3份。按照公式(1)計(jì)算可溶性固形物含量。

(1)

1.2.4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液體外抗氧化活性檢測

(1)呈坎羅氏毛豆腐浸提液總還原力的測定

采用普魯士藍(lán)法[8]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價(jià)浸提液的總還原力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(2)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[9-11]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價(jià)浸提液對超氧陰離子的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(3)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由清除能力的測定

采用水楊酸捕獲羥自由基法[12-13]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價(jià)浸提液對羥自由基的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(4)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH法[14-16]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價(jià)浸提液對DPPH自由基的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(5)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基清除率的測定

采用ABTS法[17-18]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評價(jià)浸提液對ABTS自由基的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

1.2.5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液體外抗氧化活性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan′s多重比較法分析樣本間的差異顯著性，P<0.05認(rèn)為樣本間具有顯著差異。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的營養(yǎng)成分檢測結(jié)果

營養(yǎng)成分檢測結(jié)果見表1，普通毛豆腐的pH值波動較大，呈現(xiàn)不穩(wěn)定的狀態(tài)，而呈坎羅氏毛豆腐的pH值很穩(wěn)定，呈弱堿性。呈坎羅氏毛豆腐的水分、灰分、可溶性總糖和Vc含量都略高于普通毛豆腐。呈坎羅氏毛豆腐的蛋白質(zhì)含量達(dá)到20.830 gmL，遠(yuǎn)高于普通毛豆腐的蛋白質(zhì)含量。相比普通毛豆腐，徽州呈坎羅氏毛豆腐具有更高的營養(yǎng)價(jià)值。

表1 呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的營養(yǎng)成分檢測結(jié)果Table 1 The results of nutritional components in Luo’s hariy toufu and the oridinary hariy toufu

2.2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的總還原力

還原能力強(qiáng)的物質(zhì)因其化學(xué)本質(zhì)為還原劑，將會是良好的電子供體，研究發(fā)現(xiàn)總還原力與物質(zhì)的抗氧化活性呈正相關(guān)[19]。一般情況下具有較強(qiáng)還原能力的物質(zhì)能夠把Fe3+還原成Fe2+，根據(jù)顯色反應(yīng)可以判斷其還原程度，反應(yīng)后的吸光度越大的物質(zhì)其還原能力越強(qiáng)[20]。呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc的總還原力實(shí)驗(yàn)測定的A700數(shù)值如表2所示。

由表2可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液的總還原力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。料液比降低，可溶性固形物含量增加，總還原力增加；相同的料液比，浸提溫度從35 ℃(接近體溫)升高到100 ℃(接近食品加工蒸煮溫度)，可溶性固形物含量和總還原力均明顯增加。以Vc為參照，料液比同為1∶5，35 ℃的浸提液的總還原力，與25 μg/mL的Vc相當(dāng)，而100 ℃浸提液的總還原能力明顯提升，與50 μg/mL的Vc相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液具有一定的抗氧化能力，浸提溫度的升高，有利于浸提液可溶性固形物中活性成分的有效釋放并促進(jìn)總還原力的提升。

表2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的總還原力Table 2 The reducing power of the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)；“-”表示未檢出。

2.3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對超氧陰離子自由基的清除率如表3所示。由表3可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對超氧陰離子自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對超氧陰離子自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢。以Vc為參照，實(shí)驗(yàn)中的不同浸提液，對超氧陰離子均有較好的清除能力，基本高于120 μg/mL的Vc，而且，料液比為1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液，清除能力已超過200 μg/mL Vc溶液的清除能力，說明呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子有較好的清除能力。

表3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對超氧陰離子自由基的清除率Table 3 The scavenging activity of the different extracts of Luo's hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

2.4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對羥自由基的清除率如表4所示。由表4可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對羥自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對羥基自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢。以Vc為參照，實(shí)驗(yàn)中的不同浸提液，對羥自由基均有較好的清除能力，介于120～600 μg/mL的Vc，料液比為1∶5的100 ℃浸提液對羥自由基的清除效果，已極大超過了200 μg/mL的Vc溶液的清除效果，與600 μg/mL的Vc溶液清除效果大致相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由基有較強(qiáng)的清除能力。

表4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對羥自由基的清除率Table 4 The scavenging activity of ·OH in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

2.5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對DPPH自由基的清除率如表5所示。由表5可知，兩個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對DPPH自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對DPPH自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢。以Vc為參照，料液比為1∶5的35 ℃的浸提液對DPPH自由基的清除效果，與20 μg/mL Vc溶液的清除效果相當(dāng)，而100 ℃浸提的毛豆腐浸提液對DPPH自由基清除能力，就明顯高于20 μg/mL Vc溶液，說明呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基有一定的清除能力。

表5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對DPPH自由基的清除率Table 5 The scavenging activity of DPPH· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)；“-”表示未檢出。

2.6 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對照品Vc對ABTS自由基的清除率如表6所示。由表6可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對ABTS自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對ABTS自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢。以Vc為參照，實(shí)驗(yàn)中的不同浸提液，對ABTS自由基均有較好的清除能力，介于40～200 μg/mL的Vc，料液比為1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液對ABTS自由基的清除效果與200 μg/mL的Vc溶液相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基有較好的清除能力。

表6 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對ABTS自由基的清除率Table 6 The scavenging activity of ABTS· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

3 結(jié)論

在眾多的植物性蛋白質(zhì)中，只有大豆蛋白能提供所有的必需氨基酸，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織指定的優(yōu)質(zhì)蛋白，成為越來越重要的植物蛋白資源[21-22]。本研究綜合對比分析了徽州呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的基本營養(yǎng)成分(pH、水分、灰分、蛋白質(zhì)含量、總糖含量、Vc含量)，結(jié)果顯示徽州呈坎羅氏毛豆腐蛋白質(zhì)、Vc以及可溶性總糖的含量高于普通毛豆腐，具較高的營養(yǎng)價(jià)值。

Vc是重要的水溶性捕捉型抗氧化物，能清除活性氧自由基，具抗衰老、預(yù)防心血管疾病等多種生理功能，促進(jìn)人體正常生理代謝的平衡[23-24]。吳非等的研究顯示，傳統(tǒng)霉菌發(fā)酵豆制品具有較高的抗氧化活性[25]?；罩菝垢菍碜杂诖蠖沟鞍椎亩垢匀唤臃N毛霉菌，發(fā)酵4～7 d而成。在發(fā)酵過程中因微生物及酶的作用，在毛豆腐中產(chǎn)生了許多生物活性物質(zhì)[2, 26]。本實(shí)驗(yàn)以不同浸提溫度與料液比為因素水平，研究了徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液的抗氧化活性，以闡明不同加工方式對其功能活性的影響。結(jié)果表明，徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液具有較好的總還原力和對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力。不同浸提溫度與料液比對徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液抗氧化活性的影響顯著。相比35 ℃(接近體溫)的浸提液，100 ℃(接近食品加工蒸煮溫度)的浸提液，其體外抗氧化能力明顯增強(qiáng)。本研究首次闡明了非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐的功能活性，并為其合理的加工方式提供了技術(shù)參考，為其成為可開發(fā)的抗氧化功能食品提供了理論依據(jù)。下一步將對100 ℃浸提的毛豆腐浸提液進(jìn)行主要活性成分分析，以明確抗氧化活性的主要成分。