貯前強制對流熱空氣處理對低溫脅迫下青椒果實AsA-GSH循環(huán)代謝的影響

邵婷婷，姜雪，張敏,2,3,4*，趙昱瑄，郝爽，厲建國

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2 (上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海，201306) 4 (食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306)

青椒又名燈籠椒、柿子椒、甜椒等，是茄科的一種[1]。其果肉脆嫩，顏色鮮艷，富含大量的VC，是一種營養(yǎng)價值極高且深受消費者歡迎的蔬菜。青椒果實作為我國北運的主要蔬菜之一，常采用低溫運輸，且采摘后的青椒果實為了延長其貯藏期也常采用低溫貯藏。當青椒果實的低溫貯藏溫度低于其冷害臨界溫度時會導致冷害現(xiàn)象的發(fā)生[2-5]，嚴重時還會影響青椒果實的商品價值和可食用價值，造成嚴重的經(jīng)濟損失。正常生長的果蔬細胞內(nèi)存在一個完善的活性氧產(chǎn)生和清除的保護系統(tǒng)，對于未采摘的青椒果實來說，其細胞內(nèi)的活性氧水平較低，且其產(chǎn)生和清除一直處在一個動態(tài)平衡中，活性氧不會積累，進而也就不會傷害其細胞組織。但是當采摘后的青椒果實冷藏時會受到逆境脅迫，其細胞對O2的利用能力降低，活性氧產(chǎn)生和清除系統(tǒng)的動態(tài)平衡會被打破，活性氧產(chǎn)生速率加快，而活性氧清除酶的活性和內(nèi)源抗氧化物含量降低將會造成活性氧的大量積累，甚至會誘發(fā)膜脂過氧化的發(fā)生，造成細胞受到一定程度的傷害[6]。AsA-GSH循環(huán)[7]是植物體內(nèi)清除活性氧的主要途徑，參與該循環(huán)的抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是具有多種氧化功能的物質(zhì)，其含量的降低可作為植物抗氧化能力衰退的指標。因此，研究合適的果蔬貯前處理方式對AsA-GSH循環(huán)的影響具有重要意義。

在眾多的處理方式中，熱空氣處理擁有條件簡單、經(jīng)濟成本低、易操作、無化學殘留等優(yōu)點，同時相對熱水處理而言，更易減少個體相互之間的接觸碰撞，而且減少了熱水處理過程中病原菌污染等情況，因而有著廣闊的應用市場。朱賽賽等[8]研究得出45 ℃熱空氣處理西葫蘆果實20 min能夠減緩其膜脂過氧化進程，激發(fā)抗氧化酶活性。AMBVKO等[9]研究發(fā)現(xiàn)熱空氣處理能夠提高香蕉果實低溫貯藏期間活性氧清除能力，并且AsA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)的活性也得到提高。在侯建設等[10]的試驗中，貯前經(jīng)50 ℃、10 min或53 ℃、5 min熱水處理的青椒，較未處理組而言，顯著提高了青椒APX活性，維持了活性氧代謝的平衡，抑制膜脂過氧化，具有更好的抗冷害性能。孫海燕等[11]的實驗結(jié)果表明，用(55±1)℃熱水處理30 s后的青椒，在(10±1)℃的低溫貯藏，能在一定程度上減緩青椒中丙二醛(MDA)含量的增加速率，降低腐爛指數(shù)，較好地保持了AsA含量，延長了青椒的貯藏期，提高了其耐貯性。王靜等[12]研究表明，48 ℃、30 min熱空氣處理對降低青椒病害率，延緩AsA含量的下降效果較好；60 ℃、30 min熱空氣處理可阻止葉綠素含量的下降，有效地抑制青椒果實呼吸強度上升，但其并未對青椒果實低溫脅迫下AsA-GSH循環(huán)進行研究。同時也有報道顯示熱空氣處理對草莓[13]、鮮棗[14]和楊梅[15]的低溫保鮮過程中的活性氧代謝都有很好的調(diào)節(jié)作用。而有關(guān)強制對流熱空氣處理對于青椒果實采后低溫脅迫下AsA-GSH循環(huán)清除活性氧的研究卻鮮有報道。本試驗在前期研究的基礎上，發(fā)現(xiàn)強制對流熱空氣(風速：2 m/s)處理溫度為50 ℃可以有效降低青椒果實的冷害率，因此本文重點研究在此條件強制對流熱空氣處理對低溫脅迫下青椒果實AsA-GSH循環(huán)的影響，以期為青椒果實貯藏保鮮和揭示采后果蔬熱應激在低溫脅迫下的抗冷性響應機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青椒：選用“洛椒”青椒作為試驗材料，于2018 年7月 4日采于上海市南匯新城鎮(zhèn)果園，裝于泡沫箱中當天運回實驗室。

鹽酸羥胺、NaOH、酚酞、石英砂、CaCO3粉、丙酮、草酸、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚鈉鹽、Na2HPO4、冰醋酸、還原性谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、硫代巴比妥酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；H2O2試劑盒(科研試劑),南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

BPS-100CA型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；H-2050R-1型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；THZ-82A型恒溫振蕩箱，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；BJ2100D型數(shù)字孔式電子天平，臺灣精達電子儀器有限公司；DDS-307型電導率儀，上海笛柏實驗設備有限公司；HSWX-600BS型電熱恒溫水溫箱，上海圣科儀器設備有限公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。240 mm真空干燥器，上海帥登儀器有限公司。

1.3 材料處理

挑選無明顯機械損傷、無病蟲害、色澤均一的新鮮青椒果實，裝于泡沫箱中當天運回實驗室。果實平均長度為14～17 cm，平均質(zhì)量為60～90 g。將青椒果實清洗干凈后拭干分組。根據(jù)前期試驗結(jié)果，選取有效強制對流熱空氣(風速：2 m/s；相對濕度：85%～90%)、處理溫度為50 ℃，來研究該溫度下處理青椒果實5、10、20、30和40 min，另外不經(jīng)過處理的青椒果實設為對照組，進而研究不同的強制對流熱空氣處理時間對青椒果實低溫脅迫下細胞內(nèi)AsA-GSH循環(huán)代謝的影響。將各組青椒果實處理后放于干凈的實驗臺上晾干后貼上標簽，再裝入厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋，最后放于(4±0.5)℃、相對濕度為(80±5)%的冷庫中貯藏，整個貯藏周期為21 d，每隔3 d取出青椒樣品觀察各組的冷害指數(shù)并測定其貯藏品質(zhì)、活性氧自由基含量以及AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶的酶活性，重復3次。

1.4 指標測定

1.4.1 冷害指數(shù)的測定

冷害指數(shù)的測定參照侯建設等[16]的方法來對青椒果實的冷害指數(shù)進行評定。通過觀察青椒果實果面所呈現(xiàn)出的冷害面積將冷害癥狀分為4級。其中，0級：無冷害癥狀；1級：輕微冷害，冷害斑不超過果面的10%；2級：中度冷害，冷害斑占果面積的10%～40%；4級：嚴重冷害，冷害斑超過果面的40%。

(1)

1.4.2 葉綠素和可滴定酸含量的測定

葉綠素的測定采用分光光度計[17]測定。準確稱取1 g青椒樣品于預冷的研缽中，加入少量石英砂和CaCO3粉及2～3 mL 80%的丙酮溶液，研磨成勻漿，再用80%的丙酮溶液進行沖洗過濾，收集濾液待測。

可滴定酸(titritable acidity,TA)含量的測定采用酸堿滴定法[18]進行測定。

1.4.3 電解質(zhì)外滲率和丙二醛含量的測定

電解質(zhì)外滲率的測定參考盧佳華等[19]的測定方法略作修改。從青椒果實樣品果面較寬處用打孔器取10個圓片放入有編號的燒杯中，準確加入20 mL去離子水后放于恒溫振蕩箱在轉(zhuǎn)速為150 r/min，環(huán)境溫度為25 ℃的條件下振蕩10 min后，加入20 mL去離子水并用DDS-307電導率儀測定此時的電導率值，并記為R0。再將之放入真空干燥器、恒溫振蕩培養(yǎng)箱中各1 h，結(jié)束后測定此時的電導率并記為R。用保鮮膜覆于燒杯上并把燒杯于沸水中煮沸10 min，煮沸結(jié)束后靜待恢復至室溫，測定此時的電導率R′。記錄試驗結(jié)果，并用公式(2)來算出電解質(zhì)外滲率。

(2)

丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)的方法分別測定450、532和600 nm的吸光值，并利用公式(3)計算青椒果實的MDA含量。

c/(μmol·L-1)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

(3)

過氧化氫(H2O2)含量的測定采用H2O2測試盒測定[20]。

1.4.5 AsA和GSH含量的測定

AsA含量的測定參考王慧等[22]的試驗方法，采用2,6-二氯靛酚法進行測定。

還原型谷胱甘肽(GSH)的測定參考曹建康等[21]的方法稍作修改。稱取5.0 g青椒果實樣品置于預冷好的干凈研缽中，加入5.0 mL經(jīng)4 ℃預冷的50 g/L的三氯乙酸溶液(含5 mmol/L EDTA-Na2),在冰浴條件下研磨成勻漿后，于4 ℃、12 000×g離心20 min。收集上清液待測。

1.4.6 GR和APX活性的測定

谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測定參考王萍等[23]的方法稍作修改。稱取5.0 g青椒果實樣品置于預冷好的干凈研缽中，加入5.0 mL經(jīng)4 ℃預冷的0.1 mol/L、pH 7.5的H3PO4緩沖液(含1 mmol/L EDTA)，冰浴條件下研磨成勻漿后，于4 ℃、12 000×g離心30 min。收集上清液用于酶活性測定。

抗壞血酸過氧化物酶(APX)活力的測定活性測定參照CHEN等[24]的方法，以每克樣品APX酶促反應體系在290 nm處吸光度值降低0.01為1個酶活性單位。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理，SPSS 19.0 軟件繪圖進行差異性分析。本文所有試驗為3次重復，試驗結(jié)果為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 強制對流熱空氣處理對冷藏青椒果實冷害指數(shù)的影響

圖1體現(xiàn)了各處理組青椒果實低溫貯藏期間的冷害指數(shù)變化趨勢，從圖中可知50 ℃強制對流熱空氣處理20 min組青椒果實出現(xiàn)冷害的時間最晚，比對照組推遲了6 d。且在整個低溫貯藏期，50 ℃強制對流熱空氣處理20 min組青椒果實的冷害指數(shù)在各處理組中一直處于較低水平，貯藏結(jié)束時也僅為31.25%，而50 ℃強制對流熱空氣處理5、10、30、40 min以及對照組的青椒果實冷害指數(shù)分別達到了53.13%、43.75%、54.16%、65.63%、和70.25%。

圖1 強制對流熱空氣處理對青椒果實冷害指數(shù)的影響Fig.1 Effect of forced convection hot air treatment on chilling injury index of green pepper fruit注：不同小寫字母表示各處理組之間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 強制對流熱空氣處理對冷藏青椒果實葉綠素和可滴定酸含量的影響

強制對流熱空氣處理對青椒果實低溫脅迫下葉綠素含量的影響見圖2。

圖2 強制對流熱空氣處理對青椒果實葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of forced convection hot air treatment on chlorophyll content of green pepper fruit

由圖2可以看出各處理組青椒果實的葉綠素含量呈現(xiàn)出不同幅度的下降趨勢，但50 ℃強制對流熱空氣處理20 min組的青椒果實的葉綠素含量在整個低溫脅迫下一直處于較高水平，始終高于其他各處理組。隨著冷藏時間的延長，各組青椒果實由于冷害程度加深，果實表皮發(fā)生褐變，果實內(nèi)葉綠素含量下降幅度加大，到貯藏結(jié)束時，50 ℃強制對流熱空氣處理20 min組青椒果實的葉綠素含量維持在0.069 mg/100 g，顯著高于其他各處理組。結(jié)果表明，雖然各個處理組的青椒果實的葉綠素都呈下降趨勢，但50 ℃強制對流熱空氣處理20 min能夠使其降解速度減緩，進而提高青椒果實低溫脅迫下的抗冷性。

由圖3可以看出，各組青椒果實的可滴定酸含量呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢。隨著冷藏時間的延長，青椒果實冷害程度加深，各組的可滴定酸含量也隨之下降，且到了貯藏后期下降幅度加劇，但是對于50 ℃強制對流熱空氣處理20 min來說，其青椒果實的可滴定酸下降幅度一直低于其他各處理組。貯藏到第9天時，其可滴定酸含量仍高達0.28%，顯著高于其他各處理組。

圖3 強制對流熱空氣處理對青椒果實可滴定酸含量的影響Fig.3 Effect of forced convection hot air treatment on titratable acid content of green pepper fruit

2.3 強制對流熱空氣處理對冷藏青椒果實電解質(zhì)外滲率和MDA含量的影響

由圖4可以看出，各組青椒果實在整個低溫貯藏期間的電解質(zhì)外滲率數(shù)值呈現(xiàn)出一直上升的趨勢，說明各組青椒果實隨著低溫貯藏時間的延長都發(fā)生了不同程度的冷害現(xiàn)象。但是各組青椒果實由于其貯前熱空氣處理時間的不同，其電解質(zhì)外滲率數(shù)值的上升幅度存在很大差別。貯藏到15 d時，50 ℃熱空氣處理20 min組青椒果實的電解質(zhì)外滲率數(shù)值僅比剛開始貯藏時增加了15%，而50 ℃強制對流熱空氣處理5、10、30、40 min和CK組分別增加了28%、18%、21%、35%和38%。說明50 ℃強制對流熱空氣處理20 min對于長期低溫貯藏的青椒果實來說，能夠有效保護其細胞結(jié)構(gòu)的完整性，一定程度上提高其抗冷性。

由圖5可以看出，各組青椒果實的MDA含量在整個低溫貯藏期間大致呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。在貯藏前3 d，各組青椒果實的MDA含量有一個輕微的下降，說明貯藏前期各組青椒果實的膜脂過氧化反應并沒有快速進行。而后隨著低溫貯藏時間的延長，50 ℃強制對流熱空氣處理5、30、40 min以及對照組青椒果實的MDA含量呈現(xiàn)出急劇上升的趨勢，50 ℃強制對流熱空氣處理10和20 min組青椒果實的MDA含量增加幅度較為緩慢，且50 ℃強制對流熱空氣處理20 min組青椒果實的MDA含量僅為0.00104 μmol/g，顯著低于其他各組。由此說明50 ℃強制對流熱空氣處理20 min能夠減緩青椒果實低溫貯藏期間的膜脂過氧化反應，降低其產(chǎn)物MDA的積累，進而保護細胞免受傷害。

圖4 強制對流熱空氣處理對青椒果實電解質(zhì)外滲率的影響Fig.4 Effect of forced convection hot air treatment on electrolyte extravasation rate of green pepper fruit

圖5 強制對流熱空氣處理對青椒果實MDA含量的影響Fig.5 Effect of forced convection hot air treatment on MDA content of green pepper fruit

2.4 強制對流熱空氣處理對冷藏青椒果實H2O2和含量的影響

由圖6可知，各種青椒果實中H2O2的含量呈現(xiàn)出一直上升的趨勢。在貯藏前期，各組青椒果實中H2O2的含量并無顯著性差別。貯藏到第6天以后，在同一貯藏時間下各組青椒果實中H2O2的含量由高到低的變化順序為40 min組>CK組>30 min組>5 min組>10 min組>20 min組。從圖中觀察可知，50 ℃強制對流熱空氣處理40 min組青椒果實的H2O2含量在后期高于CK組，說明該處理方式對減緩細胞H2O2的產(chǎn)生并無明顯作用。

圖6 強制對流熱空氣處理對青椒果實H2O2含量的影響Fig.6 Effect of forced convection hot air treatment on H2O2 content of green pepper fruit

圖7 強制對流熱空氣處理對青椒果實產(chǎn)生速率的影響Fig.7 Effect of forced convection hot air treatment on rate of green pepper fruit

2.5 強制對流熱空氣處理對冷藏青椒果實AsA和GSH含量的影響

由圖8可知各處理組青椒果實的AsA含量都呈現(xiàn)出下降趨勢。在貯藏前期，由于青椒果實發(fā)生冷害程度較輕，所以各組青椒果實的AsA含量下降幅度較低。貯藏到15 d時，50 ℃強制對流熱空氣處理20 min組青椒果實的AsA含量維持在81.67 mg/100 g，而50 ℃強制對流熱空氣處理5、10、30、 40 min以及CK組青椒果實的AsA含量分別為66.33、69.00、65.01、62.00和58.67 mg/100 g，顯著低于50 ℃強制對流熱空氣處理20 min。且一直到貯藏結(jié)束，其他各組青椒果實的AsA含量始終低于50 ℃強制對流熱空氣處理20 min，說明50 ℃強制對流熱空氣處理20 min較為合適，能有效抑制青椒果實低溫貯藏期間AsA的下降。

由圖9可知，各組青椒果實中GSH含量大致呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，且在第9天達到峰值。各處理青椒果實GSH的峰值按從高到低的順序變化為20 min組>10 min組>30 min組>5 min組>40 min 組>CK組。而后隨著低溫貯藏時間的延長，各組青椒果實的GSH含量都逐漸下降，到貯藏結(jié)束時ck以及5、10、30和40 min組青椒果實的GSH含量分別為0.22、0.32、0.48、0.41以及0.21 μmol/g， 而20 min組青椒果實的GSH含量仍維持在0.71 μmol/g。該結(jié)果表明，50 ℃強制對流熱空氣處理20 min能夠大幅度增加青椒果實低溫貯藏期間GSH的含量，且對于其含量的保持也有很明顯的效果，有助于青椒果實的抗逆性提升。

圖8 強制對流熱空氣處理對青椒果實AsA含量的影響Fig.8 Effect of forced convection hot air treatment on ascorbic acid content of green pepper fruit

圖9 強制對流熱空氣處理對青椒果實GSH含量的影響Fig.9 Effect of forced convection hot air treatment on GSH content of green pepper fruit

2.6 強制對流熱空氣處理對冷藏青椒果實GR和APX活性的影響

由圖10可知，各組青椒果實的GR活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，于第12天達到峰值。50 ℃強制對流熱空氣處理20 min組青椒果實的GR活性峰值最大，為CK組的2.75倍。到了貯藏后期，各組青椒果實的GR活性急劇下降，到貯藏結(jié)束時，各組青椒果實的GR活性分別為8.93、11.88、15.58、9.03、7.39和5.67 U/mg。說明50 ℃強制對流熱空氣處理20 min對于維持青椒果實的GR活性效果較好，始終處于各個處理組的最大值，進而使該組青椒果實清除活性氧的能力增強，提高其抗冷性，有利于果實品質(zhì)的保持。

采后青椒果實隨著低溫貯藏期間的延長其APX的活性變化如圖11所示，各組均呈現(xiàn)出先增加后下降的變化趨勢。

圖10 強制對流熱空氣處理對青椒果實GR活性的影響Fig.10 Effect of forced convection hot air treatment on GR activity of green pepper fruit

圖11 強制對流熱空氣處理對青椒果實APX活性的影響Fig.11 Effect of forced convection hot air treatment on APX activity of green pepper fruit

3 討論

前人研究表明熱空氣處理能夠提高西葫蘆、香蕉、草莓、鮮棗和楊梅[11-15]等果蔬在冷藏時的抗逆性，能夠有效推遲其冷害發(fā)生時間。低溫貯藏的果蔬經(jīng)過一段時間的復溫之后會出現(xiàn)不同程度的冷害癥狀。青椒果實的冷害癥狀一般表現(xiàn)為：果皮變暗，表皮產(chǎn)生不規(guī)則的凹陷斑，凹陷部位果肉中的維管束褐變等[25]。冷藏的青椒果實隨著貯藏時間的延長，其體內(nèi)的葉綠素以及可滴定酸等含量會出現(xiàn)一定程度的下降，葉綠素含量的下降可能會導致果實表皮暗淡無光，光澤降低，可滴定酸含量下降則會影響青椒果實的口感和風味。因此，常用葉綠素和可滴定酸含量的保持作為衡量果實貯藏效果的標志，也可作為鑒別果實貯藏品質(zhì)中的化學指標。本試驗結(jié)果表明，50 ℃強制對流熱空氣處理20 min能夠顯著減輕青椒果實的冷害癥狀，在整個低溫脅迫下其冷害指數(shù)均保持在較低水平。50 ℃強制對流熱空氣處理40 min 組的青椒低溫保鮮效果較差，冷害癥狀嚴重，可能是長時間的強制對流熱空氣處理使得青椒果實表面失水嚴重，抗逆性降低。青椒果實的葉綠素和可滴定酸含量在低溫貯藏期間的下降趨勢得到了減緩，表明50 ℃強制對流熱空氣處理20 min能夠提高青椒果實低溫脅迫下的抗逆性，進而使其葉綠素含量和可滴定酸含量得到較好維持。

4 結(jié)論