梁葉星,張玲*,高飛虎,張雪梅,李雪,張歡歡,楊世雄,熊家艷
1(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,重慶,401329) 2(重慶西南師范大學(xué)出版社有限公司,重慶,400716)
水豆豉,又名姜豆豉,以細(xì)菌為主制曲產(chǎn)生酶系分解黃豆中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而制成,是川渝地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品[1-2],也是具有重慶本地特色的調(diào)味品。其營(yíng)養(yǎng)全面、含有多種功能因子[3],具有抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6]、降血糖[7]、降血壓[8-10]等多種生理功能,因此重慶水豆豉有良好的市場(chǎng)前景。
大豆發(fā)酵食品具有獨(dú)特的滋味和風(fēng)味,深受廣大消費(fèi)者的喜愛,消費(fèi)需求量較大[7]。經(jīng)過發(fā)酵,大豆發(fā)酵食品的質(zhì)地口感、滋味發(fā)生了巨大變化,形成了大豆發(fā)酵食品獨(dú)特的滋味。水豆豉是細(xì)菌型豆豉的代表,其參與發(fā)酵的主要微生物是枯草芽孢桿菌、乳酸菌、微球菌等[11]。因其獨(dú)特的生產(chǎn)工藝、多樣性菌群結(jié)構(gòu)和添加辣椒、姜等調(diào)味料,使其成品具有與其他類型豆豉不同的特色滋味。
目前有對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品滋味的相關(guān)研究報(bào)道,主要集中在豆腐乳、毛霉豆豉、曲霉豆豉等。研究表明,游離氨基酸和小肽段的構(gòu)成決定了發(fā)酵食品的滋味[12-15]。索化夷等[16]對(duì)毛霉豆豉發(fā)酵過程中的滋味變化進(jìn)行了研究,表明氨基酸、還原糖等共同決定了永川毛霉豆豉特有的咸鮮回甘的滋味特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)腐乳的鮮味除了來源于谷氨酸等游離氨基酸成分,還與小分子肽段的呈鮮作用有一定關(guān)系。由于重慶水豆豉通常是在自然條件下發(fā)酵而成,導(dǎo)致其產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定,不同批次產(chǎn)品風(fēng)味口感差異大等問題,限制了其產(chǎn)品的推廣和發(fā)展。對(duì)自然接種重慶水豆豉發(fā)酵過程中滋味形成變化規(guī)律的研究,有利于評(píng)價(jià)其感官品質(zhì)形成機(jī)制。目前,水豆豉滋味形成規(guī)律的相關(guān)研究還未見報(bào)道。
本研究對(duì)重慶水豆豉在自然發(fā)酵過程中各發(fā)酵時(shí)期氨基酸、還原糖、NaCl、總酸的變化進(jìn)行了測(cè)定,通過分析總結(jié)其變化規(guī)律,為構(gòu)建重慶水豆豉感官品質(zhì)特征參數(shù),制定水豆豉產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)所用材料是經(jīng)重慶地區(qū)傳統(tǒng)水豆豉生產(chǎn)工藝自然發(fā)酵,取自不同發(fā)酵階段的重慶傳統(tǒng)水豆豉。原料是重慶本地大豆。重慶傳統(tǒng)水豆豉生產(chǎn)工藝如下:
大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸煮(煮豆水冷藏備用)→冷卻→自然接種發(fā)酵(室溫(20±2)℃)→拌料(煮豆水、食鹽含量 12 g/100 g、姜粒、辣椒面、白酒)→入壇發(fā)酵后熟(室溫(20±2)℃)→成品。
樣本采集后,樣品用濾紙吸干表面水再經(jīng)冷凍干燥后研磨過20目篩,密封存放于-18 ℃冰箱中備用。S1~S12分別代表了不同發(fā)酵時(shí)期的重慶水豆豉樣品。詳見表1。
表1 實(shí)驗(yàn)樣品的編號(hào)Table 1 Number of different experimental samples
茚三酮、磺基水楊酸、氨基酸分析儀緩沖液:賽卡姆(北京)科學(xué)儀器有限公司;3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic, DNS),其他化學(xué)試劑均為分析純:成都市科龍化工試劑廠。
S-433D氨基酸分析儀,賽卡姆科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,國(guó)華電器有限公司;GL-12A高速冷凍離心機(jī),上海菲恰爾分析儀器有限公司;UV-6000PC紫外可見光分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司;LyoQuest實(shí)驗(yàn)室凍干機(jī),西班牙泰事達(dá)科技公司。其他試驗(yàn)儀器設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。
1.3.1 還原糖、總糖含量測(cè)定
參照索化夷等方法測(cè)定[16]。
1.3.2 NaCl含量測(cè)定
參照GB/T 12457—2008 規(guī)定的間接沉淀滴定法測(cè)定[17]。
1.3.3 總酸含量測(cè)定
參照GB/T 12456—2008中的酸堿滴定法測(cè)定[18]。
1.3.4 總氨基酸和游離氨基酸測(cè)定
參照GB 5009.124—2016食品中氨基酸含量的測(cè)定[19]。
1.3.4.1 樣品總氨基酸測(cè)定前處理
采用常規(guī)酸水解-厭氧管充氮密封水解法,略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取50 mg的樣品于20 mL厭氧水解管中;向水解管中加入10 mL 6 mol/L HCl(含體積分?jǐn)?shù)0.1%苯酚),將樣品全部浸沒;將水解管放入冰塊中冷凍10 min;充高純氮?dú)?5~30 s,保持水解管豎直,不要將液面濺起,移開氮?dú)夂罅⒓瓷w好軟塞,旋緊密封蓋;將水解管置于(110±1)℃恒溫烘箱中水解22 h,水解完成后,冷卻、混勻、過濾、濾渣清洗3次,合并溶液定容到50 mL;準(zhǔn)確吸取1 mL水解液,于60 ℃濃縮至干以盡量排除其中的干擾;準(zhǔn)確加入2 mL樣品稀釋液,振蕩混勻,用0.22 μm針式過濾器過濾后供上機(jī)測(cè)定。
1.3.4.2 樣品游離氨基酸測(cè)定前處理
稱取1.00 g左右的樣品于錐形瓶中,用50 mL、0.01 mol/L HCl浸提30 min;搖勻后過濾,準(zhǔn)確吸取濾液2 mL于離心試管中,加入8%(體積分?jǐn)?shù))磺基水楊酸2 mL,混勻,靜置15 min;10 000 r/min離心10 min;取上清液,過0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。
1.3.4.3 分析條件
流動(dòng)相經(jīng)洗脫泵流過,流速0.45 mL/min;茚三酮經(jīng)衍生泵流過,流速0.25 mL/min。分離柱柱溫為38~74 ℃梯度升溫;反應(yīng)柱柱溫130 ℃。
1.3.5 感官評(píng)價(jià)
感官評(píng)價(jià)在(25±1)℃的感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。由9名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的27~45歲技術(shù)人員組成評(píng)定小組,統(tǒng)計(jì)總分,取平均值。使用各種滋味標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有小組成員進(jìn)行訓(xùn)練,以便他們能夠準(zhǔn)確地描述滋味類型和強(qiáng)度。評(píng)定小組成員分別對(duì)不同發(fā)酵階段的水豆豉產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià),評(píng)分表如表2所示。
表2 滋味感官評(píng)分表Table 2 Sensory evaluation table of flavor
1.3.6 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd)表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行線性回歸分析,P<0.05表示差異有顯著性,雙變量相關(guān)采用Pearson線性相關(guān)。
水豆豉中的咸味主要來源于NaCl,而NaCl又主要來自于水豆豉后發(fā)酵開始時(shí)添加的食鹽。由圖1可知,原料大豆中NaCl含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))可以忽略不計(jì),直到后發(fā)酵開始添加了食鹽后,NaCl逐漸滲透到水豆豉內(nèi)部,水豆豉中NaCl含量開始逐漸上升,在S9期以后,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量快速上升到10%左右,此時(shí)水豆豉湯汁中的NaCl含量和水豆豉中的NaCl含量逐漸趨于平衡,NaCl滲入水豆豉的速度減緩,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)最后保持在10.12%,略低于研究報(bào)道的貴州水豆豉成品的11.76%[20],但是已超過了SALLES等報(bào)道的Na+的呈味閾值[21],水豆豉的NaCl含量總體上低于毛霉豆豉[16]和陽(yáng)江豆豉[20],這也說明了水豆豉的咸味適中。
圖1 水豆豉發(fā)酵過程中NaCl含量的變化Fig.1 The sodium chloride content change during different fermentation stages of Shuidouchi
發(fā)酵過程中總酸含量高低直接影響水豆豉微生物生產(chǎn)和發(fā)酵進(jìn)程,同時(shí)也影響水豆豉成品的滋味形成[22]。由圖2可知,原料在浸泡和蒸煮過程后,酸度保持不變,到了前發(fā)酵時(shí)期(S4~S5),酸度開始上升,這是由于大豆經(jīng)過蒸煮之后,部分細(xì)菌得到了一定程度生長(zhǎng),分泌了大量的酶,導(dǎo)致產(chǎn)生酸性代謝物較多[23]。進(jìn)入到后發(fā)酵階段(S6以后),由于拌料過程中添加了食鹽、姜粒、辣椒面等,同時(shí)添加了煮豆水,部分有機(jī)酸溶出,導(dǎo)致后發(fā)酵開始總酸含量略有下降,進(jìn)入后發(fā)酵第3天(S7)以后,由于此階段乳酸菌等生長(zhǎng),有機(jī)酸大量增加,酸度陡然上升,之后酸度值趨于平緩,到后發(fā)酵第9天(S10)以后,由于高鹽厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的酸累積,酸度值又有一定程度上升[4],直到后發(fā)酵末期趨于穩(wěn)定,最終總酸含量達(dá)到了3.86 g/100 g,總酸含量比毛霉豆豉和曲霉豆豉的含量高[22],水豆豉發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸,最終形成了水豆豉溫和爽快的酸味口感,這可能是由于形成了乳酸、磷酸等[23]。
圖2 水豆豉發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig.2 The total acidity change during different fermentation stages of Shuidouchi
還原糖是水豆豉中甜味的來源之一,在發(fā)酵過程中主要是由微生物分解總糖轉(zhuǎn)化而來。由圖3可知,在浸泡和蒸煮過程中大豆中總糖溶出了一部分,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由19.62%下降至15.07%。在前發(fā)酵階段的最后1天(S5),總糖含量大幅度下降,進(jìn)入后發(fā)酵階段(S6以后),總糖含量緩慢下降最后變化趨于平緩,發(fā)酵成熟時(shí)總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到7.26%。由圖4可知,在前發(fā)酵初期階段,由于微生物利用,還原糖消耗量較大,而總糖轉(zhuǎn)化為還原糖的量較小,導(dǎo)致在S3期還原糖含量下降。S3期以后,還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升較快,由1.16%上升到4.19%,在前發(fā)酵的最后1天(S5),由于糖化酶活力增強(qiáng),還原糖的消耗量略高于生成量,所以還原糖的含量開始下降,進(jìn)入后發(fā)酵階段(S6以后),由于添加了煮豆水、鹽、酒等,對(duì)微生物生長(zhǎng)有一定影響,還原糖含量出現(xiàn)小幅度上升,S8期以后還原糖由于微生物的利用而逐漸下降,最后還原糖含量處于較低水平,由于水豆豉中還原糖含量較低,又沒有如毛霉豆豉等在后發(fā)酵過程中添加外源糖分,所以水豆豉成品的甜味感覺較弱。
圖3 水豆豉發(fā)酵過程中總糖含量的變化Fig.3 The total sugar content change during different fermentation stages of Shuidouchi
圖4 水豆豉發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.4 The reducing sugar content change during different fermentation stages of Shuidouchi
由表3可知,原料黃豆浸泡和蒸煮過程對(duì)于水豆豉總氨基酸含量變化影響不大,在前發(fā)酵階段(S4~S5)由于微生物分解產(chǎn)生了蛋白酶后水分的
散失,總氨基酸含量略有上升。當(dāng)進(jìn)入后發(fā)酵階段(S6以后),由于添加了煮豆水、鹽、姜、辣椒粉等配料,導(dǎo)致其總氨基酸含量下降至28.598 g/100 g。在后發(fā)酵過程中總氨基酸含量略有下降,最終含量為22.540 g/100 g,這可能是由于酶作用轉(zhuǎn)化的游離氨基酸溶于水豆豉湯汁之中。水豆豉成品中檢測(cè)出了人體的必需氨基酸,色氨酸由于酸水解過程破壞而未能檢測(cè)出含量。水豆豉總氨基酸含量中排名前5的氨基酸分別為谷氨酸(4.369 g/100 g)、亮氨酸(2.141 g/100 g)、天冬氨酸(1.914 g/100 g)、苯丙氨酸(1.492 g/100 g)、丙氨酸(1.406 g/100 g)。5種主要的氨基酸占水豆豉總氨基酸的50.23%。其主要氨基酸與永川毛霉豆豉的主要氨基酸有一定的區(qū)別[16]。
表3 水豆豉發(fā)酵過程中總氨基酸含量的變化 單位:g/100 g
注:ND表示酸水解過程中被破壞而未檢出。下同。
游離氨基酸是呈味物質(zhì),對(duì)水豆豉滋味的形成有重要作用。由表4可知,游離氨基酸在發(fā)酵前期含量較低,經(jīng)過酶系作用后,游離氨基酸在前發(fā)酵末期(S5)大幅度的增加,進(jìn)入到后發(fā)酵階段(S6以后),游離氨基酸含量繼續(xù)增大,由原料中的3.471 mg/g上升到后發(fā)酵末期的峰值42.495 mg/g,增加了11.25倍;但后發(fā)酵結(jié)束時(shí),游離氨基酸含量有一定幅度的回落,主要原因可能是后發(fā)酵結(jié)束,一方面部分游離氨基酸溶出到水豆豉湯汁中,另一方面游離氨基酸參與了發(fā)酵后期的美拉德反應(yīng),導(dǎo)致其含量下降[24]。陳清嬋研究也發(fā)現(xiàn)霉菌純種制曲豆豉游離氨基酸含量普遍呈現(xiàn)快速增加,之后有所下降的現(xiàn)象[24]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)的水豆豉其游離氨基酸按含量的高低排名前5的為Phe、Leu、Glu、Ala、Val,占水豆豉游離氨基酸總量的55.47%。這與索化夷報(bào)道的永川毛霉豆豉的氨基酸特征譜基本一致,區(qū)別在于永川毛霉豆豉特征譜中有半胱氨酸,而水豆豉則有丙氨酸[16]。
表4 水豆豉發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化 單位:mg/g
由表5可知,水豆豉在浸泡(S2)和蒸煮(S3)過程中,對(duì)整體的滋味影響不明顯,滋味都處于極弱的水平。前發(fā)酵階段(S4),逐漸產(chǎn)生了鮮味、甜味、酸味等味感,但味感較弱;至前發(fā)酵結(jié)束,鮮味和酸味出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng),甜味變化不明顯。后發(fā)酵階段(S6)開始,由于食鹽的添加,食鹽逐漸滲入水豆豉使其咸味增強(qiáng)。后發(fā)酵階段,由于微生物和酶系作用,產(chǎn)生了大量游離氨基酸和有機(jī)酸[16],水豆豉鮮味和酸味明顯增強(qiáng),苦味和甜味的變化不明顯。對(duì)水豆豉發(fā)酵過程中的NaCl含量、總酸含量、總糖含量、還原糖含量、氨基酸含量與滋味感官評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如
表6所示,水豆豉咸味與NaCl含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),說明后發(fā)酵添加食鹽是水豆豉咸味的主要來源。鮮味與游離氨基酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明發(fā)酵產(chǎn)生的鮮味游離氨基酸與水豆豉鮮味的形成有關(guān)。酸味與總酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),說明水豆豉酸味的形成與發(fā)酵過程產(chǎn)酸有關(guān)。甜味與還原糖含量相關(guān)性不顯著,甜味與游離氨基酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),甜味與總糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),表明水豆豉甜味與發(fā)酵產(chǎn)生的還原糖關(guān)聯(lián)度較小,與甜味氨基酸的形成有一定的聯(lián)系,這可能是由于水豆豉中還原糖含量較低,其他滋味對(duì)于甜味呈味有負(fù)面影響,導(dǎo)致感官品評(píng)的甜味較弱。
表5 水豆豉發(fā)酵過程中感官評(píng)分 單位:分
注:a~g不同字母表示各組數(shù)據(jù)差異具有顯著性(P<0.05)。
表6 水豆豉發(fā)酵過程中各參數(shù)的相關(guān)性矩陣表Table 6 Correlation of parameters during different fermentation stages of Shuidouchi
注:**表示在0.01水平上呈極顯著性相關(guān),*表示0.05水平上呈顯著性相關(guān)。
水豆豉具有與其他干豆豉不同的特色風(fēng)味,一方面是由于在后發(fā)酵過程中加入了姜粒和辣椒面,這賦予了水豆豉獨(dú)特的辛辣滋味,另一方面就是水豆豉在發(fā)酵過程中由于微生物作用,導(dǎo)致NaCl、總酸發(fā)生變化,對(duì)成品咸味、酸味有重要的影響。蛋白質(zhì)水解形成游離氨基酸與其味感有一定的關(guān)聯(lián),尤其是發(fā)酵豆制品中的鮮味和苦味物質(zhì)主要是由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生,不同口味的物質(zhì)在一起,會(huì)發(fā)生味道的相消、相乘等作用[25-26],最終共同形成了水豆豉獨(dú)特的滋味,其中游離氨基酸的變化對(duì)于水豆豉口味形成的作用尤其重要。
研究發(fā)現(xiàn),氨基酸的滋味可以分為鮮味(天冬氨酸、谷氨酸)、甜味(甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸)、甜苦味(賴氨酸、脯氨酸)、苦味(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸)和無味(半胱氨酸)等5大類[27-29]。水豆豉游離氨基酸排名前5的主要氨基酸為Phe、Leu、Glu、Ala和Val。廖順[30]在白腐乳的研究中發(fā)現(xiàn)其中肽Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro呈現(xiàn)鮮味,肽Asp-Glu-Asp-Phe-Lys-Arg-Glu-Pro呈現(xiàn)鮮味和酸味。索化夷[16]在對(duì)永川毛霉豆豉的研究中發(fā)現(xiàn)其呈味氨基酸譜帶為Glu+Leu+Cys+Phe+Val。HAN[26]發(fā)現(xiàn)青腐乳中,Ala、Ile、Val和Phe為主要氨基酸。不同類型的大豆發(fā)酵制品其氨基酸組成差異較大,主要可能與發(fā)酵的菌群不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解程度不一致有關(guān)[31]。
水豆豉游離氨基酸中,鮮味氨基酸占比 13.45%,甜味氨基酸占比22.25%,苦味氨基酸占比59.31%。這與干豆豉的比例相比,鮮味氨基酸占比較低,而苦味氨基酸占比較高[20,32]。謝靚等[33]用電子舌檢測(cè)出不同發(fā)酵階段豆豉滋味變化,其味覺差異主要體現(xiàn)在苦味、鮮味和咸味上,且苦味回味差別較小,這與我們?nèi)粘J秤枚刽目诟薪咏?。水豆豉食用的口感主要是咸鮮味,略帶酸味,略微有一點(diǎn)苦味和澀味。咸味主要與食鹽添加后的NaCl有關(guān),發(fā)酵結(jié)束時(shí)水豆豉中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)10.12%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出了咸味的感官閾值1 300 mg/L[21],所以其咸味的滋味明顯。鮮味主要來源于蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨基酸和短肽,鮮味呈味氨基酸主要是谷氨酸和天冬氨酸,其含量分別達(dá)到了3.69、0.931 mg/g,含量雖然不高,但是也能明顯感受到鮮味滋味。水豆豉中酸味是其特征風(fēng)味之一,發(fā)酵結(jié)束時(shí)其總酸含量高達(dá)3.86 g/100 g,使得水豆豉回味中有一定酸的滋味。另外,水豆豉中還略微有一點(diǎn)苦味,可能是苦味氨基酸和酚類物質(zhì)產(chǎn)生的[16],但由于咸鮮味感較強(qiáng)而被掩蓋,導(dǎo)致食用時(shí)僅能感受到一點(diǎn)后苦味。
綜上所述,水豆豉自然發(fā)酵過程中,其滋味主要是在后發(fā)酵階段形成。其NaCl在后發(fā)酵階段開始呈現(xiàn)逐漸上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì);酸度進(jìn)入后發(fā)酵第3天,含量陡然上升,之后酸度值趨于平緩,直到后發(fā)酵末期趨于穩(wěn)定;還原糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);總氨基酸含量下降,游離氨基酸含量增加了11.25倍。水豆豉發(fā)酵完成后按含量遞減順序確定的前5個(gè)主要特征氨基酸為Phe、Leu、Glu、Ala、Val,占水豆豉游離氨基酸總量的55.47%。水豆豉中NaCl、還原糖、總酸、呈味氨基酸與后發(fā)酵階段添加的辣椒、姜等混合最終形成了重慶水豆豉獨(dú)特的鮮咸酸辣略有回甜的滋味。