肉蓯蓉苯乙醇總苷對脂多糖致大鼠急性肺損傷的抑制作用

由淑萍，汪 波，趙 軍，馬 龍，張石蕾，劉 濤

（新疆醫(yī)科大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.護理學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊830004）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種常見的臨床危重急癥，其主要發(fā)病機制是過度失控的炎癥反應(yīng)和促炎-抗炎反應(yīng)失衡［1］，雖然臨床上對ALI 的治療有一些新的突破，但發(fā)病率和死亡率依然居高不下。目前，ALI 的病因被歸納為直接因素和間接因素2大類，直接因素包括嚴(yán)重的肺部感染、吸入性肺炎和肺或胸部挫傷等，間接因素包括全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥和重度胰腺炎等。尹剛等［2］以敗血癥大鼠ALI 模型作為間接因素，研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉對敗血癥所致大鼠ALI具有良好的保護作用。直接因素的肺部感染中，革蘭陰性桿菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是引起ALI 及死亡的主要原因之一［3］。本課題組前期研究結(jié)果表明，肉蓯蓉苯乙醇總苷（Cistanche phenylethanol glycosides，CPhG）是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，具有保護神經(jīng)、抗高原肺水腫和腦水腫、保肝護肝、抗氧化、增加人體免疫功能和延緩衰老等多種功效［4］。但肉蓯蓉是否能夠?qū)PS等直接因素所致的ALI起到保護作用尚未見報道。基于此，本研究采用經(jīng)口氣管插管后霧化給予LPS溶液建立大鼠ALI模型，使LPS直接作用于肺組織，模擬臨床上直接因素如肺部感染、吸入性肺炎所致的ALI，觀察CPhG對ALI模型大鼠血清生化指標(biāo)、細胞因子以及肺組織病理變化的影響，初步闡明CPhG 對LPS 所致大鼠ALI的保護作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

SPF 級健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心，合格證號SCXK（新）2016-0002，使用許可證號為SYXK（新）2016-0003。動物實驗的所有相關(guān)程序由新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

CPhG（產(chǎn)地：新疆和田，批號：20180502）（和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司），主要包含松果菊苷與毛蕊花糖苷2 種成分，CPhG 純度≥85.0%，其中松果菊苷純度≥40.0%，毛蕊花糖苷純度≥16.0%，用0.5%羧甲纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）（西安正天藥用輔料有限公司）將CPhG配制成不同濃度混懸液，置4℃冰箱保存待用。LPS（北京索萊寶生物有限公司）。

醋酸地塞米松片（dexamethasone acetate，Dex）（浙江仙琚制藥股份有限公司）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutatathione，GSH）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitric oxide，NO）含量檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。

TDL-40C 型離心機（上海安亭），BC-5000Vet全自動血細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），HH-501 恒溫水浴鍋（常州萬合儀器制造有限公司），全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司），紫外分光光度計（日本島津儀器公司），霧化注射器（北京慧榮和科技有限公司）。

1.2 實驗分組和處理

雄性SD 大鼠60 只。隨機分為6 組，正常對照組、模型（LPS 3 mg·kg-1）、模型+Dex 2 mg·kg-1（陽性藥對照組）、模型+CPhG 125，250和500 mg·kg-1處理組［3，5］，每組10 只。各用藥組大鼠均ig 給予相應(yīng)劑量受試物，正常對照組、模型組和模型+Dex 2 mg·kg-1組給予蒸餾水，連續(xù)30 d，陽性藥對照組大鼠于造模前1 h ig給予Dex 2 mg·kg-1。

在第31天，各組大鼠除正常對照組外，其余組大鼠均ip給予1%戊巴比妥鈉溶液（80 mg·kg-1）麻醉，采用霧化注射器給予LPS 3 mg·kg-1建立大鼠ALI模型，此次大鼠麻醉復(fù)蘇時間約1 h。

1.3 樣本采集和指標(biāo)檢測

造模后3 h進行第2次麻醉，經(jīng)腹主動脈采血處死大鼠，全自動血細胞分析儀檢測中性粒細胞百分比［6］，其余血液于4℃，1500×g離心15 min，取上清液保存于-80℃超低溫冰箱，檢測MDA，NO，SOD和GSH 含量或活性［7］。結(jié)扎右肺，暴露氣管并插管，向左肺注入4℃，PBS 溶液3 mL 進行支氣管肺泡灌洗，重復(fù)3次。于4℃、1500×g離心15 min，收集上清液，分裝后保存于-80℃超低溫冰箱保存，ELISA 試劑盒檢測細胞因子IL-1β，IL-6 和TNF-α的含量；取大鼠右肺后葉，甲醛固定，HE 染色做病理組織學(xué)檢查，觀察肺組織病理改變并行組織病理評分，每個實驗組隨機選取6張病理切片進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)選用Szarka等［8］建立的病理學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)，將肺損傷情況分為0～Ⅳ級（表1）；中葉稱重（濕重g）后，將其置于80℃干燥箱內(nèi)，干燥48 h后取出，稱重（干重g），計算肺濕/干重（W/D）比重。

Tab.1 Pathological classifications standard for acute lung injury（ALl）

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CPhG 對LPS 致急性肺損傷大鼠全血中性粒細胞百分比的影響

全自動血細胞分析儀檢測結(jié)果（表2）顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠全血中性粒細胞百分比明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，模型+CPhG 500 mg·kg-1組大鼠全血中性粒細胞百分比明顯下降（P＜0.05），且其作用優(yōu)于模型+Dex 2 mg·kg-1組（P＜0.05），并且中性粒細胞百分比隨劑量的增加而降低（r=-0.465，P＜0.05）。

2.2 CPhG對LPS致急性肺損傷大鼠右肺中葉W/D比值的影響

LPS致ALI大鼠右肺中葉W/D比值結(jié)果（表3）顯示，與正常對照組相比，模型組W/D 比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，Dex 可顯著逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的大鼠W/D 比值升高（P＜0.05），模型CPhG125 和250 mg·kg-1組W/D 比值變化無統(tǒng)計學(xué)差異，模型+CPhG 500 mg·kg-1組W/D比值顯著降低（P＜0.05）。隨著劑量的增加，W/D比值呈現(xiàn)逐步降低的趨勢（r=-0.429，P＜0.05）。

Tab.2 Effect of Cistanches phenylethanol glycosides（CPhG）on percentage of neutrophils in lipopolysacharide（LPS）-induced ALl rats

Tab.3 Effect of CPhG on lung wet/dry（W/D）mass ratio in LPS-induced ALl rats

2.3 CPhG 對LPS 致急性肺損傷大鼠血清中SOD和GSH活性及MDA和NO含量的影響

SOD和GSH活性及MDA和NO含量測定結(jié)果（表4）顯示，與正常對照組相比，模型組SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 和NO 含量升高（P＜0.05）；與模型相比，模型+CPhG 500 mg·kg-1組大鼠血清中SOD 和GSH 活性明顯增加（P＜0.05），并且血清中GSH 活性均有隨著CPhG 劑量增加而增加的趨勢（r=0.376，P＜0.05），而MDA和NO的含量明顯降低（P＜0.05），其中，模型+CPhG 500 mg·kg-1組MDA和NO含量降低明顯（P＜0.05）。

2.4 CPhG 對LPS 致急性肺損傷大鼠肺泡灌洗液TNF-α，lL-1β和lL-6含量的影響

ELISA結(jié)果（表5）顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α，IL-1β 和IL-6 含量均明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，模型+Dex 2 mg·kg-1陽性對照組和模型+CPhG 500 mg·kg-1組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α 和IL-6 明顯降低（P＜0.05），TNF-α含量隨著CPhG劑量增加而降低（r=-0.505，P＜0.01）。

2.5 CPhG對LPS致急性肺損傷大鼠肺組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果（圖1）顯示，正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁表面光滑，肺泡腔清晰，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肺間質(zhì)增寬，肺泡壁毛細血管擴張充血，可見大量中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞浸潤，支氣管周圍可見大量淋巴細胞、漿細胞，淋巴濾泡增生；模型+Dex 2 mg·kg-1組可見肺泡隔增寬，肺泡壁毛細血管壁充血，炎細胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)可見水腫液、漏出的紅細胞和滲出的炎細胞；模型+CPhG125 mg·kg-1組可見大量炎癥細胞浸潤，炎性改變區(qū)域明顯減少，間隔變窄，炎癥有所改善；模型+CPhG 250 mg·kg-1組炎性區(qū)域更少，趨于好轉(zhuǎn)；模型+CPhG 500 mg·kg-1組基本看不到增寬的肺泡間隔。

Tab.4 Effect of CPhG on serum SOD and GSH activity and MDA and NO content in LPS-induced ALl rats

肺組織病理分級結(jié)果及非參數(shù)檢驗（表6）可見，與正常對照組比較，各劑量組秩均值顯著升高（P＜0.01）；而與模型組相比，模型+CPhG各劑量組秩均值顯著降低（P＜0.01），其中模型+CPhG 500 mg·kg-1組秩均值接近于模型+Dex 2 mg·kg-1組。

Tab.5 Effect of CPhG on interleukin-1β（lL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and lL-6 levels in alveolar lavage fluid of LPS-induced ALl rats

Fig.1 Effect of CPhG on lung pathological sections of rats with ALl（HE staining）.See Tab.1 for the rat treatment.

Tab.6 Effect of CPhG on lung pathological classification in LPS-induced ALl rats

3 討論

本研究結(jié)果顯示，CPhG 能夠在一定程度上減輕大鼠ALI 模型肺部炎癥程度，緩解肺水腫的程度。ALI 多由炎癥介質(zhì)及效應(yīng)細胞共同參與，并呈現(xiàn)級聯(lián)放大的炎癥繼發(fā)性損傷與繼發(fā)性彌漫性肺實質(zhì)損傷。有隨機調(diào)查表明，ALI 患者死亡率高達35%～40%，隨著醫(yī)療水平不斷提升，ALI 患者的生存率已明顯改善。研究表明，大部分苯乙醇類化合物具有抗炎作用［9］，有研究者從玄參中提取得到苯乙醇苷類化合物，發(fā)現(xiàn)苯乙醇苷濃度0.5 mmol·L-1時能夠?qū)Π兹〣4 產(chǎn)生較強的抑制作用，證明其具有抗炎作用，苯乙醇苷類化合物對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有抑制作用，其抗炎作用主要依賴于其甲氧基的存在。

本研究采用經(jīng)口氣管插管后霧化給予LPS 溶液建立大鼠ALI 模型，使LPS 溶液隨著大鼠的呼吸均勻地分布于各個肺葉，導(dǎo)致肺組織呈瀑布樣炎癥反應(yīng)，其病理生理過程與臨床上間接因素所致的ALI相符合。模型組大鼠在染毒后1 h，出現(xiàn)點頭樣呼吸，口唇略發(fā)紺，可聞及粗濕啰音，從全血中性粒細胞百分比和肺泡灌洗液中炎癥因子水平來看，模型組大鼠各項炎癥指標(biāo)明顯高于正常對照組；模型組大鼠肺組織病理切片顯示，肺組織毛細血管充血和炎癥細胞浸潤等一系列明顯的炎癥改變，提示模型建立成功。

急性炎癥反應(yīng)的血象以中性粒細胞升高為主，它是反映炎癥嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，模型+CPhG 各劑量組大鼠中性粒細胞百分比有不同程度的下降，其中模型+CPhG 500 mg·kg-1組降低明顯，提示CPhG 在一定程度上能夠減少中性粒細胞的增加，從而減少向炎癥部位趨化的中性粒細胞，在一定程度上減輕了炎癥反應(yīng)。

肺組織W/D 比值直觀地反映了肺組織水腫的程度，而肺水腫是導(dǎo)致急性呼吸衰竭的主要原因。本研究結(jié)果顯示，模型+Dex 2 mg·kg-1肺水腫程度最輕，最接近于正常對照組，其余各組大鼠右肺中葉W/D比值較正常對照組均明顯升高。但是模型+CPhG 500 mg·kg-1組W/D比值明顯低于模型組，并且肺水腫程度隨著劑量的增加而減輕，這表明CPhG能夠降低肺部急性炎癥中肺水腫的程度。

SOD 和GSH 是機體內(nèi)重要的抗氧化活性物質(zhì)，能夠在急性炎癥反應(yīng)中減少自由基的產(chǎn)生，從而減輕肺組織損傷的程度，而MDA 是氧自由基作用于脂質(zhì)的氧化終產(chǎn)物。從本研究結(jié)果來看，CPhG 能夠增加大鼠血清中SOD 活性和GSH 含量，降低大鼠血清中MDA 含量，提示CPhG 能夠通過增強抗氧化作用從而減輕炎癥對于肺部的損傷程度。NO 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮多方面的介質(zhì)作用，能夠擴張血管，增加其通透性，增加炎性細胞的滲出。本研究結(jié)果顯示，模型+CPhG 500 mg·kg-1組大鼠血清中NO 含量與模型組相比有明顯降低，提示CPhG可能能夠減少NO的產(chǎn)生而減輕肺部的炎癥反應(yīng)。

主要分泌IL-1β 的細胞包括肺泡巨噬細胞，它能夠促進中性粒細胞從骨髓釋放，誘導(dǎo)單核細胞和粒細胞向病灶趨化，釋放溶酶體酶和炎癥因子。TNF-α對肺組織有較強的損傷作用，它能夠誘導(dǎo)肺內(nèi)皮細胞活化、白細胞遷移、粒細胞脫顆粒和毛細血管滲漏，使水腫液大量積聚在肺泡，妨礙了肺泡細胞灌流和物質(zhì)交換的功能［10］，從而引起ALI。IL-6在急性炎癥反應(yīng)中處于中心地位，能夠誘導(dǎo)B 細胞分化，誘導(dǎo)單核細胞分化，增強NK細胞活性。本研究結(jié)果表明，與模型組相比，CPhG可降低大鼠肺泡灌洗液中TNF-α，IL-1β和IL-6含量，提示CPhG可通過減少炎癥介質(zhì)的釋放減輕ALI病程中出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷的程度從而起到一定的保護作用。

本研究病理組織學(xué)觀察顯示，與模型組相比，模型+CPhG 不同劑量組的炎癥反應(yīng)程均有不同程度的減輕，尤其是模型+CPhG 500 mg·kg-1組有明顯好轉(zhuǎn)，基本看不到增寬的肺泡間隔。提示CPhG 可減少肺泡毛細血管擴張充血的區(qū)域，減少炎細胞的浸潤，縮小炎癥灶，改善炎癥反應(yīng)。從肺組織病理分級的非參數(shù)檢驗來看，模型CPhG 各劑量組秩均值顯著降低，其中模型+CPhG 500 mg·kg-1組秩均值接近于模型+Dex 2 mg·kg-1組，同樣提示CPhG可減輕肺部的炎癥損傷。

綜上所述，CPhG 對LPS 誘導(dǎo)的ALI 具有一定的抑制作用，其機制可能與其抗氧化活性、減輕肺水腫程度和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。CPhG可對ALI模型大鼠的中性粒細胞、血清生化指標(biāo)、細胞因子及肺組織病理產(chǎn)生影響，從而對LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI起到抑制作用。本研究為臨床應(yīng)用CPhG防治ALI及研發(fā)新型藥物提供了實驗依據(jù)，具體的作用機制還有待深入研究。