藥物致癌試驗中常用動物歷史對照數(shù)據(jù)研究進展

于春榮＊，尹紀業(yè)＊，笪紅遠，高廣花，馬 璟，王慶利

（1.國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心，北京100022；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850；3.國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203）

隨著國內(nèi)創(chuàng)新藥物研發(fā)的推進，需要進行致癌性評價的新藥大量出現(xiàn)，致癌評價成為藥物審評關注的焦點。致癌試驗一般采用1項2年期大鼠試驗和1項2年期小鼠試驗組合，或1項2年期大鼠試驗和1項6個月期的轉(zhuǎn)基因小鼠試驗組合。致癌試驗由于周期長且結(jié)果數(shù)據(jù)繁多，除了要考慮受試物的分類、作用機制、劑量-效應關系、腫瘤的發(fā)生部位和合適的統(tǒng)計學分析等信息外，其試驗結(jié)果的分析還需要有充足的自發(fā)性腫瘤背景數(shù)據(jù)可供參考，以幫助判斷腫瘤發(fā)生率的增加是否與給藥相關，用于進一步判斷與人類的相關性。致癌試驗中，同期對照組數(shù)據(jù)（有時是雙空白對照組）能提供最具有相關性的對照，以確定哪些腫瘤是藥物作用引起的。然而，在遇到罕見腫瘤和發(fā)病率異常的腫瘤時只能尋求可靠的歷史對照數(shù)據(jù)加以解釋判斷。

迄今為止，多個不同嚙齒類動物品系被用于致癌性試驗。致癌試驗的標準操作方案最早由經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）（1981 年）和美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）（Redbook，1982年）頒布，形成了開展嚙齒類動物2 年致癌性試驗的標準試驗研究方案，但對嚙齒類動物品系的選擇未做明確要求。20 世紀70 年代后期開始，美國國家癌癥研究所/美國國家毒理學計劃（National Cancer Institute/National Toxicology Program，NCI/NTP）大多選用F344大鼠和B6C3F1小鼠開展致癌試驗，而制藥企業(yè)則在致癌試驗中較多使用Wistar 大鼠、SD 大鼠和CD-1 小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠在20 世紀90 年代后期逐漸被使用。據(jù)統(tǒng)計，到2011年，美國FDA藥品評價與研究中心（FDA Center for Drug Evaluation and Research，CDER）40%的研究方案來自rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠［1］。

當前可參照的歷史對照數(shù)據(jù)主要來自機構(gòu)（工業(yè)毒理學動物數(shù)據(jù)登記處（Registry of Industrial Toxicology Animal Data，RITA），NTP 和Charles River（表1）和已發(fā)表論文（表2）。因各機構(gòu)的數(shù)據(jù)庫在不斷維護更新中，本文未涉及。本綜述主要對已發(fā)表論文的數(shù)據(jù)予以梳理，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)主要有不同種屬自發(fā)性腫瘤性病變、特定系統(tǒng)或器官的自發(fā)性腫瘤病變（垂體、神經(jīng)、腎上腺、眼球和卵巢等組織）及歷史對照數(shù)據(jù)的評估和使用規(guī)范等類型?？傮w上呈現(xiàn)的時間趨勢是，早期論文主要關注歷史對照數(shù)據(jù)的建立和完善，近幾年逐漸過渡到特定系統(tǒng)和器官的數(shù)據(jù)對比。

表1 有關致癌試驗中動物自發(fā)性腫瘤歷史對照數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫

本綜述按動物品系，對上述論文中致癌性試驗的正常對照組動物出現(xiàn)的自發(fā)性腫瘤進行了歸納，并對比自發(fā)性腫瘤的發(fā)生特點（種類、發(fā)生率和發(fā)生率范圍），進一步認識歷史對照數(shù)據(jù)的發(fā)展現(xiàn)狀，從而增加從業(yè)人員對實驗動物自發(fā)性腫瘤的了解，為致癌性試驗的順利開展提供數(shù)據(jù)支持。

表2 已經(jīng)發(fā)表的有關致癌試驗中動物自發(fā)性腫瘤歷史對照數(shù)據(jù)的論文

1 SD大鼠歷史對照數(shù)據(jù)

Baldrick［5］匯總了SD大鼠的13個致癌試驗（雌雄各765只）（表3）。試驗中全部雌雄SD大鼠平均生存率分別為38%～57%和22%～48%。惡性腫瘤發(fā)生率達12%～15%。最常見的腫瘤為內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，其中垂體腺瘤最高，在雌雄SD大鼠發(fā)生率分別為70.3%和49.3%。纖維腺瘤是SD 大鼠乳腺腫瘤中最多見的類型（發(fā)生率為55.6%），腺癌發(fā)生率高于腺瘤。其他常見腫瘤見于皮膚系統(tǒng)，包括乳腺纖維腺瘤、乳腺腺癌、乳腺腺瘤、皮膚纖維瘤、皮膚角化棘皮瘤和雄性動物毛囊腫瘤。常見的生殖系統(tǒng)腫瘤是睪丸間質(zhì)細胞瘤和子宮內(nèi)膜間質(zhì)息肉。雄大鼠淋巴細胞白血病是血液系統(tǒng)最常見腫瘤。

Chandra 等［3］（1992 年）總結(jié)了17 個致癌試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)（2669 只正常對照組SD 大鼠）。結(jié)果顯示，雌雄大鼠總的腫瘤發(fā)生率分別為22.4%和14.9%，生存率分別為41%～53%和42%～65%，惡性腫瘤發(fā)生率17%～19%。最常見的腫瘤類型也是內(nèi)分泌腫瘤。雌大鼠常見腫瘤依次為乳腺腫瘤（31.3%）、甲狀腺C 細胞瘤（2.9%）、子宮內(nèi)膜間質(zhì)息肉（2.6%）、腎上腺皮質(zhì)腺瘤（1.9%）、惡性淋巴瘤（1.6%）、皮膚纖維瘤（1.3%）和胰島細胞腺瘤（1.1%）。雄大鼠常見腫瘤依次為良性嗜鉻細胞瘤（4.0%）、皮膚角化棘皮瘤（4.0%）、胰島細胞腺瘤（3.7%）、甲狀腺C細胞瘤（3.6%）、皮膚纖維瘤和鱗狀細胞乳頭狀瘤（2.0%）、肝細胞腺瘤（2.0%）、惡性淋巴瘤（1.9%）、組織細胞肉瘤（1.4%）和腎上腺皮質(zhì)腺瘤（1.2%）。

Harleman 等［36］（2012 年）比較了RITA 數(shù)據(jù)庫中正常對照組2158只SD大鼠和5419只Wistar大鼠乳腺腫瘤的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠乳腺腫瘤發(fā)生率遠低于SD大鼠（24%vs 58%），并且Wistar大鼠乳腺腫瘤和子宮腫瘤的發(fā)生率呈反比關系，這可能與催乳素的釋放有關。

Weber等［37］（2017年）對比了SD大鼠和Wistar大鼠的自發(fā)性腫瘤的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠的總體腫瘤發(fā)生率也低于SD 大鼠，主要是與雌Wistar 大鼠垂體腺瘤和乳腺腫瘤的發(fā)生率低于雌SD 大鼠（垂體腺瘤：64%vs 70%；乳腺腫瘤：22.3%vs 72%）有關。

表3 SD大鼠常見自發(fā)性腫瘤發(fā)生率

2 Wistar大鼠歷史對照數(shù)據(jù)

Poteracki 等［7］匯總了Wistar 大鼠的5 個致癌試驗（正常對照組雌雄各465 只），雌雄大鼠腫瘤發(fā)生率分別為78%〔361/1599，腫瘤總數(shù)為1599 個（注：一個動物可發(fā)生多個腫瘤）〕和89%（415/1599），其中良性腫瘤占81%（1293/1599），惡性腫瘤占19%（306/1599）。發(fā)生率最高的腫瘤為垂體腺瘤和雌性乳腺纖維腺瘤（表4）。

表4 Wistar大鼠常見自發(fā)性腫瘤發(fā)生率

Carlus等［8］報道了Wistar Hannover大鼠（雌雄各470 只）自發(fā)性腫瘤的發(fā)生情況（表5），與Wistar大鼠腫瘤類型和發(fā)生率差別不大，腫瘤主要見于內(nèi)分泌系統(tǒng)、表皮和生殖系統(tǒng)等。

3 F344大鼠歷史對照數(shù)據(jù)

Haseman 等［11］（1998 年）匯總了NTP 1990-1997 年結(jié)束的致癌試驗（雌雄動物數(shù)范圍分別為1282～1351 只和1333～1354 只）。數(shù)據(jù)顯示，總的腫瘤發(fā)生率高達96%，其中惡性腫瘤發(fā)生率，雌雄分別為43%和64%（表6）。高發(fā)腫瘤中，雄性動物睪丸間質(zhì)細胞瘤發(fā)生率達89.1%，單核細胞白血病也是F344 大鼠常見的惡性腫瘤（雌雄動物分別為28.1%和50.5%）。此外，內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤在該品系大鼠中也普遍高發(fā)，其中雌雄動物垂體腺瘤的發(fā)生率分別為54.2%和30.4%。可見，F(xiàn)344大鼠是多種腫瘤的易發(fā)種屬，發(fā)生率總體上高于SD 大鼠和Wistar 大鼠，且雌雄動物腫瘤發(fā)生率差異大。2 年期雄性大鼠致癌試驗平均生存率約為50%，雄性大鼠主要的死亡原因與白血病、垂體腺瘤和嚴重的腎病等有關。

Tennekes等［43］對比了20年間自發(fā)性腫瘤發(fā)生率隨時間的變化情況，SD 大鼠的子宮內(nèi)膜間質(zhì)息肉（僅雌性）和腸系膜淋巴結(jié)血管瘤的發(fā)生率呈升高的趨勢，總體上，這種腫瘤發(fā)生率的變化在Wistar大鼠和SD大鼠多于F344大鼠，并指出此種時間相關的變化可能主要與基因漂移有關。Kuroiwa等［44］對比了同一個實驗室內(nèi)腫瘤發(fā)生率隨時間變化的趨勢，發(fā)現(xiàn)甲狀腺C 細胞瘤、雄性動物胰腺胰島細胞腺瘤和子宮腺癌的發(fā)生率有升高的趨勢，且與時間相關的變化可能主要與動物本身的因素而非環(huán)境因素有關。Gopinath［45］發(fā)現(xiàn)某些腫瘤發(fā)生率隨時間也存在一定波動，但無顯著差異，其中乳腺纖維腺瘤發(fā)生率存在隨時間逐漸增加的趨勢，同時垂體腺瘤（雌雄）發(fā)生率存在隨時間逐漸下降的趨勢。

表5 Wistar Hannover大鼠常見自發(fā)性腫瘤發(fā)生率

4 B6C3F1小鼠歷史對照數(shù)據(jù)

Haseman等［11］匯總了NTP開展的小鼠的21個致癌試驗（正常對照組雌雄動物數(shù)范圍分別為1092～1353 只和1341～1355 只）。數(shù)據(jù)顯示，肝腫瘤的發(fā)生率最高，肺腫瘤、惡性淋巴腫瘤、脾血管瘤和血管肉瘤發(fā)生率也較高，垂體等內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率相對偏低（表7）。

5 CD-1小鼠歷史對照數(shù)據(jù)

Chandra等［14-15］匯總了正常對照組小鼠雌雄各725只。肺泡/支氣管腺瘤、淋巴網(wǎng)狀細胞瘤和肝細胞腺瘤是CD-1 小鼠的常見腫瘤，且發(fā)生率存在雌雄差異。其中雄性小鼠發(fā)生率最高的腫瘤為肺泡/支氣管腺瘤（19.3%），而雌性小鼠發(fā)生率最高的腫瘤為淋巴網(wǎng)狀細胞瘤（16.4%）。

表6 F344大鼠常見自發(fā)性腫瘤發(fā)生率

表7 B6C3F1小鼠常見自發(fā)性腫瘤發(fā)生率

Son 等［18］（2004 年）總結(jié)了CD-1 小鼠20 個致癌試驗（正常對照組小鼠1453只）中50周前死亡小鼠腫瘤發(fā)生率（死亡率0.07%）。結(jié)果顯示，淋巴瘤發(fā)生率最高（22.8%）和肺泡/支氣管腺瘤（0.04%）。Bertrand等［29］（2014年）比較了2002-2013年致癌試驗中不同品系動物神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)CD-1小鼠神經(jīng)腫瘤發(fā)生率80周為0.2%，108周為0.42%。

6 轉(zhuǎn)基因小鼠歷史對照數(shù)據(jù)

2年期大鼠致癌性試驗因其種屬特異性致癌機制和高發(fā)的自發(fā)性腫瘤，對人類腫瘤相關性的預測能力因此常被質(zhì)疑。自1996 年轉(zhuǎn)基因小鼠模型出現(xiàn)在人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會議（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）S1B 指導原則中以來，美國FDA 已經(jīng)接受使用轉(zhuǎn)基因小鼠模型開展致癌性研究［9］。目前，可用的轉(zhuǎn)基因小鼠有Tg.rasH2，p53+/-，xpa-/-和Tg.AC 等。rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠于1989 年由日本中央實驗動物研究所（Central Institute for Experimental Animals，CIEA）建立。rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有預測準確率高（達76%），試驗周期短的特點，因而被廣泛使用［46］。

Nambiar 等［20］（2012 年）匯總了rasH2 小鼠的11 個致癌性試驗（正常對照組雌雄動物分別為363 只，333 只）（表8）。作者還總結(jié)了文獻中rasH2的高發(fā)腫瘤：支氣管/肺泡腺瘤（5.3%～5.4%）、脾血管肉瘤（3.0%～3.7%）、皮膚鱗狀細胞乳頭狀瘤（1.3%～1.8%）、淋巴瘤（0.3%～2.4%）和胃鱗狀細胞乳頭狀瘤（0.6%～1.3%）。由于轉(zhuǎn)基因小鼠縮短了試驗周期，高發(fā)的腫瘤發(fā)生率均＜10%。在腫瘤發(fā)生譜上，轉(zhuǎn)基因小鼠與BALB/c和C57BL/6等小鼠相似。

表8 rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠常見自發(fā)性腫瘤發(fā)生率［20］

7 結(jié)語

自發(fā)性腫瘤發(fā)生率具有雌雄差異。從上述數(shù)據(jù)可見，不同品系大鼠和小鼠的腫瘤發(fā)生率都具有雌雄差異。由于Wistar和SD大鼠的內(nèi)分泌系統(tǒng)如垂體、甲狀腺和乳腺等部位腫瘤高發(fā)，即呈現(xiàn)為雌性腫瘤發(fā)生率遠高于雄性，這主要與大鼠特有的高催乳素水平有關［36］。而在其他品系如F344，B6C3F1和CD-1小鼠中，則呈現(xiàn)為雄性腫瘤發(fā)生率遠高于雌性。Cook 等［47］指出，雄性動物癌的總發(fā)生率是雌性動物的1.69倍（性器官除外），而人也存在相似的趨勢?；瘜W致癌物引起的腫瘤也存在雌雄差異，原因可能與性激素受體表達，以及遺傳易感性、飲食熱量控制和體質(zhì)量等多種因素有關［48］。

歷史對照數(shù)據(jù)具有很重要的意義和價值。在致癌性研究中，毒性病理學家通過對比給藥組動物和同期對照組的病變（增生性病變和腫瘤）發(fā)生率的差異，以判斷該病變是否與藥物作用相關，進一步確定是否具有致癌性。由于動物數(shù)量的限制和個體差異等原因，使得判斷藥物相關的病理改變和有劑量-效應關系的病理變化時常常受到“干擾”，這就需要參考有效的歷史對照數(shù)據(jù)，特別是在出現(xiàn)罕見腫瘤的組間差異時，或者對照組和給藥組均有發(fā)生時，又或者某一腫瘤發(fā)生率略超出同期對照的范圍時［38］。不同種屬實驗動物的腫瘤自發(fā)病變數(shù)據(jù)不僅在致癌試驗評價中提供參考，對于其他較長時間的動物試驗中發(fā)現(xiàn)的病變進行分析評價也是一個有價值的資料。

有些因素會使歷史對照數(shù)據(jù)受到影響。歷史對照數(shù)據(jù)的價值很大程度上取決于數(shù)據(jù)的一致性。本綜述引用的NTP 項目中的數(shù)據(jù)是當年最大的F344大鼠和B6C3F1小鼠的背景數(shù)據(jù)庫（1998年），并在病理診斷時采用病理工作組（Pathology Working Group）形式以確保數(shù)據(jù)的一致性。因此，一致性越好的數(shù)據(jù)參考價值越大。影響數(shù)據(jù)一致性的因素包括解剖修切等組織處理過程，病理學家的診斷標準和術語的使用，以及動物種屬、來源、設施環(huán)境、溶媒、飼料和給藥途徑等因素。其中，病理學家的標準術語的使用和診斷的一致性影響較大。國際通用的大小鼠術語和診斷標準（International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria for Lesions in Rats and Mice，INHAND）［49］提供了最新的診斷術語，供全球毒性病理學家參考。按照我國新法規(guī)的要求，切實做好同行評議，必將大大增加病理診斷的一致性和可靠性，并可進一步建立各機構(gòu)內(nèi)部的對照數(shù)據(jù)庫。

綜上，歷史對照數(shù)據(jù)在致癌試驗中具有獨特的重要性。首先，參考已有的歷史對照數(shù)據(jù)，提高致癌性試驗的設計和結(jié)果的判讀水平。其次，不斷提高組織病理診斷術語的規(guī)范化建設，加強同行評議、實驗室內(nèi)部和不同實驗室間的歷史對照數(shù)據(jù)的共建共享。