• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    分子動力學模擬研究干燥阿達木單抗的活性保護

    2019-10-08 06:27林介一李代禧劉寶林
    軟件 2019年6期
    關鍵詞:保護劑

    林介一 李代禧 劉寶林

    摘 ?要: 阿達木單抗是一種可與TNF-α特異性結合從而阻斷自身免疫炎癥反應的蛋白質藥物。這種藥物在凍干過程中結構不穩(wěn)定且容易失活,嚴重影響了藥物的療效。本文用Gromacs分子動力學軟件工具包研究蔗糖和海藻糖對阿達木單抗的活性結構穩(wěn)定效果,揭示了保護劑對阿達木單抗的保護機制,從而為凍干工藝中阿達木單抗的處方設計提供了科學的篩選方法。結果表明,在300K條件下(二次升華溫度),不添加保護劑時,阿達木單抗的活性結構會被完全破壞;而在蔗糖和海藻糖存在的情況下,阿達木單抗的熱穩(wěn)定性得到明顯提高,并且蔗糖體系和海藻糖體系相比,表現出更好的保護效果,從而更好地抑制了阿達木單抗由于干燥失水而導致的結構塌縮和變性失活。

    關鍵詞: 阿達木單克隆抗體;活性結構;分子保護;分子動力學;保護劑

    中圖分類號: TP319 ? ?文獻標識碼: A ? ?DOI:10.3969/j.issn.1003-6970.2019.06.005

    本文著錄格式:林介一,李代禧,劉寶林,等. 分子動力學模擬研究干燥阿達木單抗的活性保護[J]. 軟件,2019,40(6):2126

    【Abstract】: Adalimumab is a TNF-inhibiting, anti-inflammatory, biologic medication. It binds to tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), which normally binds to TNFα receptors, leading to the inflammatory response of autoimmune diseases. For the purpose to provide rational screen method for developing the freeze-drying formulation, the Gromacs was used to research the stabilization effect of sucrose and trehalose on the adalimumab. The results showed in the follows. The bioactive structure of adalimumab was completely destructed under temperature 300K in the absence of any protectants. The two protectants can obviously stabilize the bioactive structure of adalimumab. And sucrose more effectively inhibit the bioactive structural denature and the collapse of the adalimumab than sucrose during the loss of bound water.

    【Key words】: Adalimumab; Bioactive structure; Molecular protection; Molecular dynamics

    0 ?引言

    阿達木單抗是一種通過抑制TNF-α治療免疫疾病(科恩病,強制性脊柱炎,銀屑?。┑亩垠w蛋白質藥物[1,2]。目前,商品化的阿達木單抗(humira)是液體注射劑,這種制劑的貯存和運輸成本較高[3,4]。然而,凍干工藝可以解決這個問題同時能夠賦予蛋白質藥物更好的穩(wěn)定性[5]。

    在凍干工藝中,為特定蛋白質設計處方是一項關鍵工作[6]。Annika等人[7]用菊粉作為口服疫苗的凍干保護劑,相較于溶液配方有效提高了疫苗的穩(wěn)定性。St?rtzel等人[8]探究了精氨酸/蔗糖保護劑對于蛋白質藥物在凍干工藝中的關鍵溫度、藥品外觀以及穩(wěn)定性的影響,為蛋白質藥物的處方開發(fā)提供了經驗。傳統(tǒng)凍干保護劑的開發(fā)方法主要采用基于傳統(tǒng)經驗的重復試錯。而如今讓凍干工藝開發(fā)更具科學性和邏輯性已成為行業(yè)共識和迫切需求。同時,隨著我國對知識產權保護的重視,開發(fā)個性且高效的藥物處方也越來越緊迫。因此,了解蛋白質變性以及其與保護劑相互作用的機理是當今處方開發(fā)的必然要求。

    隨著計算機技術的發(fā)展,使分子動力學模擬計算蛋白質分子在干燥狀態(tài)下的變化機制成為可能。李代禧等人[9]用分子動力學模擬研究了LEA蛋白對胰島素的保護效果并分析了保護劑機理,說明了LEA蛋白在干燥狀態(tài)下為胰島素提供了類似水分子的溶劑環(huán)境而有效的保護了藥物活性。本文模擬了干燥狀態(tài)下蔗糖和海藻糖與阿達木單克隆抗體的相互作用及其活性結構變化,從不同角度分析了蔗糖和海藻糖對阿達木單抗的活性保護效果及保護機理,從而為處方開發(fā)提供了新的方法以及理論指導。

    1 ?理論與方法

    阿達木單抗的初始結構(圖1A)取自于蛋白質數據庫(ID:3wd5),并通過添加氯離子平衡阿達木單抗所帶的凈電荷(+5e)。蔗糖和海藻糖分子結構通過Gaussview 5.0構建并使用Gaussian09軟件包,采用B3LYP/6-311++G**方法進行結構優(yōu)化至收斂,優(yōu)化后的分子結構如圖1B所示。

    本文使用Gromacs5.0.5工具包[10-12]在恒溫恒容(NVT)條件下分別模擬了蔗糖和海藻糖與阿達木單抗在真空環(huán)境中的相互作用。在凍干工藝中,最終產品的水分含量約為2%[13]。因此,為了研究的準確性,同樣向模擬體系中添加相應含量的水分子。各體系的詳細組成如表1所示。阿達木單抗采用Amber99sb-ildn 力場,保護劑分子采用Amber 通用分子力場,水分子模型選擇TIP3P模型。分子間Lennard-Jones與范德華相互作用的截斷半徑選擇1.4 nm[14]。靜電相互作用修正采用Particle Mesh Ewald方法[15]。

    首先,將阿達木單抗初始結構置于10 × 10 × ?10 nm的周期性盒子中。然后,在阿達木單抗周圍隨機定量添加保護劑分子和水分子,并采用最速下降法[16]進行1000步結構優(yōu)化,再以LINear Constraint Solver (LINCS)[17]方法限制住所有化學鍵的鍵長,利用Maxwell分布設置體系各原子的初始速度。所有體系都在300K條件下進行模擬,并采用Velocity- rescale方法控制體系溫度,耦合常數選為0.1。系統(tǒng)壓力采用Berendsen方法維持在1 atm左右。之后,再將準備好的體系分別進行5 ns NVT 限制性預平衡,使體系中保護劑分子和水分子在阿達木單抗周圍均勻分布。最后,將處理好的體系模型在NVT系綜下進行100 ns常規(guī)分子動力學模擬。對照組以同樣方法模擬,取模擬的最后10 ns軌跡進行數據分析[18]。

    2 ?結果與討論

    2.1 ?不同保護劑對阿達木單抗結構穩(wěn)定性的影響

    均方根偏差[19](Root Mean Square Deviation, RMSD)可以反映特定構想與初始結構的偏離程度,其值越小表明特定構象與初始結構越接近[20]。圖2A為不同體系中阿達木單抗的均方根偏差隨時間變化的均值(RMSD)。從圖2A中可看出,添加了保護劑的阿達木單抗的RMSD值相較于對照組(1.75 nm)有了顯著降低,這表明在干燥狀態(tài)下蔗糖和海藻糖都有效地增強了阿達木單抗活性結構的穩(wěn)定性。但是,由阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的RMSD值分別是0.20 nm和0.22 nm,可以看出,蔗糖比海藻糖保護效果更好。

    回旋半徑[21](Radius of gyration, Rg)的定義為蛋白質結構中每個粒子與體系質心距離的幾何平均值,其值反映了粒子結合的緊密程度,即粒子結合越緊密,Rg越小。圖2B為不同體系中阿達木單抗的回旋半徑(Rg)隨時間變化的均值。從圖2B可知,對照組中阿達木單抗的回旋半徑是3.38 nm。阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的Rg值分別是2.34 nm和2.32 nm??梢?,相較于對照組,海藻糖和蔗糖顯著抑制了阿達木單抗的Rg值的升高,這表明干燥狀態(tài)下阿達木單抗的分子形變得到了抑制。另外,相比于天然初始結構,阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的Rg值較低,這表明干燥狀態(tài)下的阿達木單抗會由于水分的流失發(fā)生塌縮。但是,由阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的Rg值可以看出,蔗糖對蛋白質塌縮抑制更好。

    2.2 ?不同保護劑對阿達木單抗相對自由能的影響

    圖3分別展示了干燥狀態(tài)下(參照組)阿達木單抗的相對自由能面圖[22](A)及其相對自由能最低點處阿達木單抗的構象(B)。由圖3A可見,藍色區(qū)域顏色越深,構象落到該區(qū)域概率越大,表明其相對自由能越低,構象越穩(wěn)定。圖3A中局部最小點的相對自由能值為5.04 kT,阿達木單抗在此點的構象如圖3B所示。顯然與天然態(tài)(圖1A)相比, ? ? 在干燥環(huán)境中阿達木單抗構象的二聚體結構發(fā)生分離,兩條鏈往相反的方向拉伸,說明了疏水環(huán) ?境中阿達木單抗無法維持活性結構。疏水作用力作為維持蛋白質結構的主要驅動力[23,24],在極端缺水環(huán)境中,疏水作用力失衡造成阿達木單抗的結構的破壞。

    圖4和圖5分別展示了阿達木單抗分別在蔗糖和海藻糖保護下的相對自由能面圖及其相對自由能最低點處阿達木單抗的構象。在蔗糖和海藻糖保護下阿達木單抗的自由能最小值分別為8.48 kT和8.40 kT。與參照組中阿達木單抗的自由能勢阱5.04 kT相比,蔗糖和海藻糖均有效地提高了阿達木單抗在疏水環(huán)境中的熱穩(wěn)定性。并且在蔗糖和海藻糖保護下的阿達木構象(圖5)與天然態(tài)(圖1A)相比并沒有發(fā)生明顯的變化。這表明蔗糖和海藻糖有效地抑制了干燥狀態(tài)下阿達木單抗雙鏈的分離,穩(wěn)定了蛋白質的三維結構。但是從保護效果來看,依然是蔗糖優(yōu)于海藻糖。

    2.3 ?蔗糖和海藻糖對阿達木單抗親疏水表面的影響

    親疏水表面積指的是蛋白質的親水和疏水殘基的溶劑可及表面積[25],其值越大則殘基在環(huán)境中的暴露面積越大。圖6A為阿達木單抗的時間平均親疏水表面積。從圖6A中可以看出,與天然態(tài)相比,對照組中阿達木單抗的親水表面積顯著降低,與之相反,疏水表面積則發(fā)生劇烈的升高,最終導致親疏水面發(fā)生反轉??梢姼稍锖蟮陌⑦_木單抗分子結構發(fā)生了巨大的形變。此外,在蔗糖和海藻糖體系中阿達木單抗的親水面積均有所降低,但仍高于對照組,而疏水表面積則與天然態(tài)相近。這些結果表明,兩種保護劑均可以有效抑制阿達木單抗疏水殘基的外翻和親水殘基的內卷;但在極端脫水環(huán)境中阿達木單抗分子內的親水相互作用增強,親水表面積收縮。從親疏水表面積變化結果總體評價來看,蔗糖比海藻糖能更好地抑制阿達木單抗在干燥狀態(tài)下活性結構的形變。

    2.4 ?不同保護劑對阿達木單抗二級結構的影響

    無規(guī)則卷曲、β-折疊和α-螺旋是蛋白質構象主要的二級結構。圖6B展示了不同體系中阿達木單抗二級結構在干燥狀態(tài)下的變化情況。從圖6B可知,相較于天然阿達木單抗,對照組中阿達木單抗的無規(guī)則卷曲數目有顯著的升高,而β-折疊和α-螺旋的數量則發(fā)生顯著降低。這表明在干燥環(huán)境中,阿達木單抗的二級結構大量轉變成無規(guī)則卷曲,使得蛋白質的活性結構發(fā)生了較大的改變。α-螺旋有助于提高蛋白質的熱穩(wěn)定性[26,27],隨著干燥環(huán)境中阿達木單抗的α-螺旋的解旋,對照組阿達木單抗的熱穩(wěn)定性降低,與3.2節(jié)的結果相印證。而添加了蔗糖和海藻糖保護的阿達木單抗二級結構的變化則較小,其中蔗糖體系的阿達木單抗的無規(guī)則卷曲、β-折疊以及α-螺旋更接近天然初始狀態(tài),因此蔗糖的保護效果最好。

    2.5 ?保護劑與阿達木單抗相互作用分析

    蔗糖和海藻糖都有效地維持了阿達木單抗在干燥狀態(tài)下的活性結構穩(wěn)定性,但二者的保護效果存在一定的差異。為了探究其原因,我們統(tǒng)計了截斷半徑0.35nm范圍內阿達木單抗與保護劑之間形成的氫鍵數目以及單抗周圍的保護劑數目(圖7A)。結果分析可知,相比于海藻糖,蔗糖吸附在阿達木蛋白質表面的分子數目更多,并且也生成了更多的氫鍵。同時,通過計算聚集在阿達木單抗分子周圍保護劑的溶劑可及表面積(圖7B),可知蔗糖吸附和保護阿達木單抗的表面積更大。綜上說明蔗糖更容易占有阿達木單抗的表面為蛋白質提供更接近水溶劑的氫鍵環(huán)境,從而保護蛋白質結構。

    3 ?結論

    本文利用分子動力學模擬研究了干燥狀態(tài)下蔗糖和海藻糖分別對阿達木單抗活性結構的保護作用。結果表明,阿達木單抗分子因其具有極高柔性在干燥狀態(tài)下會發(fā)生較大的形變導致分子變性失活。本研究中的兩種保護劑可以通過氫鍵作用為干燥狀態(tài)下的阿達木單抗分子提供類似于水溶液中的氫鍵環(huán)境,保護其蛋白質結構,且與海藻糖相比,蔗糖的干燥活性保護作用更好。本研究認為,相較于傳統(tǒng)研究與生產中選擇的海藻糖[28],蔗糖更適合作為阿達木單抗的凍干保護劑[29]。

    參考文獻

    [1] Hu S, Liang S, Guo H, et al. Comparison of the Inhibition Mechanisms of Adalimumab and Infliximab in Treating Tumor Necrosis Factor α-Associated Diseases from a Molecular View [J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(38): 27059-67.

    [2] HUMIRA Injection [package Insert] [J]. North Chicago, IL, USA: AbbVie, 2014,

    [3] Schiestl M, Stangler T, Torella C, et al. Acceptable changes in quality attributes of glycosylated biopharmaceuticals [J]. Nature Biotechnology, 2011, 29(4): 310-2.

    [4] Frokjaer S, Otzen D E. Protein drug stability: a formulation challenge [J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4(4): 298-306.

    [5] Langford A, Bhatnagar B, Walters R, et al. Drying of biopharmaceuticals: Recent developments, new technologies and future direction [J]. Japan Journal of Food Engineering, 2018, 19(1): 15-25.

    [6] Costantino H R, Pikal M J. Lyophilization of Bioph-armaceuticals [M]. AAPS press, 2004

    [7] Borde A, Ekman A, Larsson A, et al. Preparation and preclinical evaluation of a freeze-dried formulation of a novel combined multivalent whole-cell/B-subunit oral vaccine against enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea [J]. European Journal of Pharmaceutics & Biopharmaceutics, 2016, 108(11): 18-24.

    [8] St?rtzel P, Gieseler H, Gieseler M, et al. Freeze Drying of l-Arginine/Sucrose-Based Protein Formulations, Part I: Influence of Formulation and Arginine Counter Ion on the Critical Formulation Temperature, Product Performance and Protein Stability [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2015, 104(7): 2345-58.

    [9] 張燕, 李代禧, 郭柏松, et al. 低溫干燥過程中LEA-motif對熱敏性藥物胰島素的活性保護研究 [J]. 應用化工, 2014, (8): 1540-3.

    [10] Van D S D, Lindahl E, Hess B, et al. GROMACS: fast, flexible, and free [J]. Journal of Computational Chemistry, 2005, 26(16): 1701-16.

    [11] 王宏濤, 孫劍偉. 基于BP神經網絡和SVM的分類方法研究 [J]. 軟件, 2015, 36(11): 96-9.

    [12] 陳慧, 陳建華. 基于描述長度和層次聚類的Context模型量化 [J]. 軟件, 2015, 36(12): 38-41.

    猜你喜歡
    保護劑
    納米復合漿料摻入量對硅丙混凝土保護劑性能的影響
    凍干益生菌微膠囊保護劑及抗性研究
    中低溫煤焦油加氫保護劑積炭實驗研究
    淺談涂覆溶劑型保護劑對金屬表面外觀的影響因素
    微流控法低溫保護劑添加及去除線型優(yōu)化研究
    豬瘟疫苗凍干保護劑的篩選及免疫效果評價
    造口護膚粉聯合皮膚保護劑治療放射性濕性皮炎的研究
    低溫保護劑熱物性分析與冰晶的顯微研究
    納米低溫保護劑提高卵母細胞玻璃化保存效果的機理初探
    胃底腺息肉與Hp感染、抑酸劑及黏膜保護劑關系的研究
    欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩欧美精品免费久久| videossex国产| 一区二区三区免费毛片| 69av精品久久久久久| 少妇丰满av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 男女那种视频在线观看| 国产成人a区在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 校园春色视频在线观看| 国产精品永久免费网站| 久久久a久久爽久久v久久| 在线播放国产精品三级| 国产在视频线在精品| 丝袜喷水一区| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美一级a爱片免费观看看| 真实男女啪啪啪动态图| 精品一区二区三区av网在线观看| 国内精品久久久久精免费| 久久久久久久久中文| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久久久中文| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| av福利片在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 女同久久另类99精品国产91| 插逼视频在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩精品青青久久久久久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲av中文av极速乱| 99国产极品粉嫩在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲美女黄片视频| 一区福利在线观看| 久久中文看片网| 国产亚洲91精品色在线| 变态另类丝袜制服| 国产精品女同一区二区软件| 久久6这里有精品| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精华一区二区三区| 乱系列少妇在线播放| 一级黄片播放器| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费黄网站久久成人精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 中文字幕久久专区| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩欧美 国产精品| 久久国产乱子免费精品| 国产精品一及| 国产一区二区激情短视频| 国产精品精品国产色婷婷| 久久6这里有精品| 男插女下体视频免费在线播放| 午夜激情欧美在线| 成年av动漫网址| 国产色婷婷99| 日韩成人伦理影院| h日本视频在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 免费看a级黄色片| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲熟妇熟女久久| 日本爱情动作片www.在线观看 | a级一级毛片免费在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av免费在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲人与动物交配视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产视频一区二区在线看| av天堂在线播放| 午夜a级毛片| 国产高清视频在线观看网站| 日韩欧美免费精品| 日韩欧美精品免费久久| 伦理电影大哥的女人| 18+在线观看网站| 伦理电影大哥的女人| 亚洲一区二区三区色噜噜| 午夜影院日韩av| 久久久久久久久大av| 亚洲av成人av| 日本免费a在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩在线观看h| 久久99热这里只有精品18| 国产精品三级大全| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 变态另类丝袜制服| 亚洲18禁久久av| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久色成人| 99热这里只有精品一区| 少妇的逼水好多| 特级一级黄色大片| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲国产精品成人综合色| 精品欧美国产一区二区三| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久人妻av系列| 亚洲性久久影院| 在线观看66精品国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产高清有码在线观看视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产亚洲欧美98| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 看片在线看免费视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日韩人妻高清精品专区| 国产成人91sexporn| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 天堂动漫精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 人妻少妇偷人精品九色| 如何舔出高潮| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 看十八女毛片水多多多| 久久欧美精品欧美久久欧美| 97超视频在线观看视频| 免费看美女性在线毛片视频| 好男人在线观看高清免费视频| 人妻久久中文字幕网| 欧美最黄视频在线播放免费| 白带黄色成豆腐渣| 在线观看av片永久免费下载| 草草在线视频免费看| 一级毛片久久久久久久久女| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品久久久久久成人av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 在线天堂最新版资源| www日本黄色视频网| 久久精品影院6| 国产精品久久久久久av不卡| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲电影在线观看av| 搡老岳熟女国产| 黑人高潮一二区| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产精品成人久久小说 | 九九爱精品视频在线观看| 在线国产一区二区在线| 欧美三级亚洲精品| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 性插视频无遮挡在线免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品人妻视频免费看| 丰满乱子伦码专区| 插阴视频在线观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 可以在线观看毛片的网站| 小说图片视频综合网站| 搡老岳熟女国产| 露出奶头的视频| 国产淫片久久久久久久久| 中文字幕免费在线视频6| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产成人精品久久久久久| 久久精品国产清高在天天线| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产美女午夜福利| 国产色爽女视频免费观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本与韩国留学比较| 99在线人妻在线中文字幕| 性色avwww在线观看| 国产精品伦人一区二区| 91在线观看av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日日撸夜夜添| 日韩强制内射视频| 麻豆成人午夜福利视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 99热全是精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 在线观看免费视频日本深夜| 一级a爱片免费观看的视频| 国产黄a三级三级三级人| 久久久久九九精品影院| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产高清激情床上av| 搡老妇女老女人老熟妇| 夜夜夜夜夜久久久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 久久6这里有精品| 免费在线观看成人毛片| 99久久精品一区二区三区| 国内精品美女久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 狠狠狠狠99中文字幕| 女人被狂操c到高潮| 亚洲无线观看免费| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲国产欧美人成| 一本一本综合久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美成人a在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久色成人| 亚洲丝袜综合中文字幕| 悠悠久久av| 欧美精品国产亚洲| 久久久久国内视频| 级片在线观看| 在线天堂最新版资源| 一进一出好大好爽视频| 亚洲五月天丁香| 亚洲第一电影网av| 国产精品不卡视频一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久久久久大av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美3d第一页| 看黄色毛片网站| 国产三级中文精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 丝袜美腿在线中文| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日韩国内少妇激情av| av天堂在线播放| 深爱激情五月婷婷| 如何舔出高潮| 国语自产精品视频在线第100页| 国产高清激情床上av| av卡一久久| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一级黄色大片毛片| 精品一区二区免费观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 乱码一卡2卡4卡精品| 在线a可以看的网站| 亚洲美女视频黄频| 嫩草影院入口| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲18禁久久av| 可以在线观看的亚洲视频| 人人妻人人看人人澡| 日本与韩国留学比较| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产不卡一卡二| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品国产亚洲av天美| 免费观看在线日韩| 天堂√8在线中文| 午夜爱爱视频在线播放| 在线国产一区二区在线| 日日啪夜夜撸| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费av观看视频| 国产av在哪里看| av卡一久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利高清视频| 一级毛片久久久久久久久女| 久久草成人影院| 亚洲av五月六月丁香网| 99久久精品热视频| 午夜免费激情av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美3d第一页| 精品不卡国产一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 在线观看午夜福利视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 22中文网久久字幕| 欧美性猛交黑人性爽| 国产视频内射| 不卡视频在线观看欧美| 成人国产麻豆网| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产av麻豆久久久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 欧美在线一区亚洲| 久久久精品大字幕| 亚洲美女黄片视频| 一区二区三区免费毛片| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品久久电影中文字幕| 不卡一级毛片| 成人漫画全彩无遮挡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 精品一区二区三区人妻视频| 露出奶头的视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲性久久影院| 精品一区二区免费观看| 国产真实乱freesex| 中文资源天堂在线| 午夜影院日韩av| videossex国产| 国产色婷婷99| 日本与韩国留学比较| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美日韩在线观看h| 夜夜爽天天搞| 国产色婷婷99| 嫩草影视91久久| 舔av片在线| 亚洲图色成人| 91久久精品电影网| av在线天堂中文字幕| 亚洲图色成人| 日本免费一区二区三区高清不卡| 嫩草影院新地址| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本五十路高清| 99riav亚洲国产免费| 中文字幕av在线有码专区| 久久亚洲精品不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜a级毛片| 国产精品一区www在线观看| 国产免费男女视频| 国产男人的电影天堂91| 午夜激情欧美在线| 欧美最新免费一区二区三区| 色哟哟·www| 成年女人毛片免费观看观看9| 中文亚洲av片在线观看爽| 综合色av麻豆| 国产av一区在线观看免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 精品久久久久久久末码| 波多野结衣巨乳人妻| 国产伦精品一区二区三区视频9| 热99re8久久精品国产| 黄色日韩在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 内地一区二区视频在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产亚洲精品综合一区在线观看| www.色视频.com| 国产精品一二三区在线看| 国产高清不卡午夜福利| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费看a级黄色片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人freesex在线 | 亚洲久久久久久中文字幕| 嫩草影视91久久| 97热精品久久久久久| 尾随美女入室| 免费av毛片视频| 久久精品国产亚洲网站| 日本成人三级电影网站| 久久久久久久午夜电影| 级片在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日本欧美国产在线视频| 亚洲最大成人中文| 国产成人福利小说| 亚洲美女搞黄在线观看 | 男女视频在线观看网站免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品一及| 久久久国产成人精品二区| 色哟哟哟哟哟哟| 久久6这里有精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久久伊人网av| 免费看日本二区| 两个人的视频大全免费| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲精品av在线| 97超视频在线观看视频| 成年av动漫网址| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产精品成人久久小说 | 女同久久另类99精品国产91| 深爱激情五月婷婷| 联通29元200g的流量卡| 久久这里只有精品中国| 女人被狂操c到高潮| 久久热精品热| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色配什么色好看| 黄色视频,在线免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲国产精品成人久久小说 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲精品色激情综合| 99久国产av精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精华一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 偷拍熟女少妇极品色| 国产在视频线在精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 简卡轻食公司| 精品熟女少妇av免费看| 69av精品久久久久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成年免费大片在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久久久国产网址| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 级片在线观看| 日本色播在线视频| 在线看三级毛片| 18+在线观看网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久6这里有精品| 国产精品99久久久久久久久| 久久久久久久午夜电影| 久久久久久久亚洲中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 啦啦啦啦在线视频资源| 中文字幕av成人在线电影| 最近在线观看免费完整版| 插逼视频在线观看| av卡一久久| 国产毛片a区久久久久| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美最黄视频在线播放免费| 草草在线视频免费看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 嫩草影视91久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国内精品美女久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 成年版毛片免费区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 联通29元200g的流量卡| 天堂动漫精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产欧美日韩精品亚洲av| 天堂网av新在线| 久久久久久久久久黄片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日韩中字成人| 夜夜夜夜夜久久久久| 91久久精品电影网| 国产人妻一区二区三区在| 免费无遮挡裸体视频| 免费搜索国产男女视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 啦啦啦韩国在线观看视频| 高清日韩中文字幕在线| 中文字幕免费在线视频6| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久99热6这里只有精品| 精华霜和精华液先用哪个| 晚上一个人看的免费电影| 草草在线视频免费看| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 天堂网av新在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产探花在线观看一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 看黄色毛片网站| 国产成人福利小说| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产淫片久久久久久久久| 国产成人精品久久久久久| 国产淫片久久久久久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 最近手机中文字幕大全| 国产免费一级a男人的天堂| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 91在线精品国自产拍蜜月| 黄色日韩在线| 久久午夜亚洲精品久久| 嫩草影视91久久| 成人二区视频| 亚洲美女视频黄频| 老女人水多毛片| 国产高清视频在线观看网站| 可以在线观看毛片的网站| 综合色丁香网| 黄色日韩在线| 国产精品久久视频播放| 白带黄色成豆腐渣| 最后的刺客免费高清国语| 悠悠久久av| 成年免费大片在线观看| 欧美bdsm另类| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av美国av| 成人精品一区二区免费| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲av.av天堂| 久久人妻av系列| 有码 亚洲区| 亚洲欧美日韩东京热| 性色avwww在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩在线观看h| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲国产色片| 亚洲第一区二区三区不卡| 三级毛片av免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 99久久精品热视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久久久久久成人| 六月丁香七月| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产亚洲91精品色在线| av专区在线播放| 国产男人的电影天堂91| 国产色婷婷99| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线播放无遮挡| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产成人a∨麻豆精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一进一出抽搐动态| 色在线成人网| 国产91av在线免费观看| 久久99热这里只有精品18| 一本精品99久久精品77| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人精品一区二区免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 日本熟妇午夜| 久久午夜福利片| 国产成人精品久久久久久| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲av中文av极速乱| 精品日产1卡2卡| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 免费大片18禁| 精品不卡国产一区二区三区| 国产真实乱freesex| 亚洲自拍偷在线| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲内射少妇av| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品国产av成人精品 | 可以在线观看的亚洲视频| 国产不卡一卡二| 成人欧美大片| 69人妻影院|