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    分子動力學模擬研究干燥阿達木單抗的活性保護

    2019-10-08 06:27林介一李代禧劉寶林
    軟件 2019年6期
    關鍵詞:保護劑

    林介一 李代禧 劉寶林

    摘 ?要: 阿達木單抗是一種可與TNF-α特異性結合從而阻斷自身免疫炎癥反應的蛋白質藥物。這種藥物在凍干過程中結構不穩(wěn)定且容易失活,嚴重影響了藥物的療效。本文用Gromacs分子動力學軟件工具包研究蔗糖和海藻糖對阿達木單抗的活性結構穩(wěn)定效果,揭示了保護劑對阿達木單抗的保護機制,從而為凍干工藝中阿達木單抗的處方設計提供了科學的篩選方法。結果表明,在300K條件下(二次升華溫度),不添加保護劑時,阿達木單抗的活性結構會被完全破壞;而在蔗糖和海藻糖存在的情況下,阿達木單抗的熱穩(wěn)定性得到明顯提高,并且蔗糖體系和海藻糖體系相比,表現出更好的保護效果,從而更好地抑制了阿達木單抗由于干燥失水而導致的結構塌縮和變性失活。

    關鍵詞: 阿達木單克隆抗體;活性結構;分子保護;分子動力學;保護劑

    中圖分類號: TP319 ? ?文獻標識碼: A ? ?DOI:10.3969/j.issn.1003-6970.2019.06.005

    本文著錄格式:林介一,李代禧,劉寶林,等. 分子動力學模擬研究干燥阿達木單抗的活性保護[J]. 軟件,2019,40(6):2126

    【Abstract】: Adalimumab is a TNF-inhibiting, anti-inflammatory, biologic medication. It binds to tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), which normally binds to TNFα receptors, leading to the inflammatory response of autoimmune diseases. For the purpose to provide rational screen method for developing the freeze-drying formulation, the Gromacs was used to research the stabilization effect of sucrose and trehalose on the adalimumab. The results showed in the follows. The bioactive structure of adalimumab was completely destructed under temperature 300K in the absence of any protectants. The two protectants can obviously stabilize the bioactive structure of adalimumab. And sucrose more effectively inhibit the bioactive structural denature and the collapse of the adalimumab than sucrose during the loss of bound water.

    【Key words】: Adalimumab; Bioactive structure; Molecular protection; Molecular dynamics

    0 ?引言

    阿達木單抗是一種通過抑制TNF-α治療免疫疾病(科恩病,強制性脊柱炎,銀屑?。┑亩垠w蛋白質藥物[1,2]。目前,商品化的阿達木單抗(humira)是液體注射劑,這種制劑的貯存和運輸成本較高[3,4]。然而,凍干工藝可以解決這個問題同時能夠賦予蛋白質藥物更好的穩(wěn)定性[5]。

    在凍干工藝中,為特定蛋白質設計處方是一項關鍵工作[6]。Annika等人[7]用菊粉作為口服疫苗的凍干保護劑,相較于溶液配方有效提高了疫苗的穩(wěn)定性。St?rtzel等人[8]探究了精氨酸/蔗糖保護劑對于蛋白質藥物在凍干工藝中的關鍵溫度、藥品外觀以及穩(wěn)定性的影響,為蛋白質藥物的處方開發(fā)提供了經驗。傳統(tǒng)凍干保護劑的開發(fā)方法主要采用基于傳統(tǒng)經驗的重復試錯。而如今讓凍干工藝開發(fā)更具科學性和邏輯性已成為行業(yè)共識和迫切需求。同時,隨著我國對知識產權保護的重視,開發(fā)個性且高效的藥物處方也越來越緊迫。因此,了解蛋白質變性以及其與保護劑相互作用的機理是當今處方開發(fā)的必然要求。

    隨著計算機技術的發(fā)展,使分子動力學模擬計算蛋白質分子在干燥狀態(tài)下的變化機制成為可能。李代禧等人[9]用分子動力學模擬研究了LEA蛋白對胰島素的保護效果并分析了保護劑機理,說明了LEA蛋白在干燥狀態(tài)下為胰島素提供了類似水分子的溶劑環(huán)境而有效的保護了藥物活性。本文模擬了干燥狀態(tài)下蔗糖和海藻糖與阿達木單克隆抗體的相互作用及其活性結構變化,從不同角度分析了蔗糖和海藻糖對阿達木單抗的活性保護效果及保護機理,從而為處方開發(fā)提供了新的方法以及理論指導。

    1 ?理論與方法

    阿達木單抗的初始結構(圖1A)取自于蛋白質數據庫(ID:3wd5),并通過添加氯離子平衡阿達木單抗所帶的凈電荷(+5e)。蔗糖和海藻糖分子結構通過Gaussview 5.0構建并使用Gaussian09軟件包,采用B3LYP/6-311++G**方法進行結構優(yōu)化至收斂,優(yōu)化后的分子結構如圖1B所示。

    本文使用Gromacs5.0.5工具包[10-12]在恒溫恒容(NVT)條件下分別模擬了蔗糖和海藻糖與阿達木單抗在真空環(huán)境中的相互作用。在凍干工藝中,最終產品的水分含量約為2%[13]。因此,為了研究的準確性,同樣向模擬體系中添加相應含量的水分子。各體系的詳細組成如表1所示。阿達木單抗采用Amber99sb-ildn 力場,保護劑分子采用Amber 通用分子力場,水分子模型選擇TIP3P模型。分子間Lennard-Jones與范德華相互作用的截斷半徑選擇1.4 nm[14]。靜電相互作用修正采用Particle Mesh Ewald方法[15]。

    首先,將阿達木單抗初始結構置于10 × 10 × ?10 nm的周期性盒子中。然后,在阿達木單抗周圍隨機定量添加保護劑分子和水分子,并采用最速下降法[16]進行1000步結構優(yōu)化,再以LINear Constraint Solver (LINCS)[17]方法限制住所有化學鍵的鍵長,利用Maxwell分布設置體系各原子的初始速度。所有體系都在300K條件下進行模擬,并采用Velocity- rescale方法控制體系溫度,耦合常數選為0.1。系統(tǒng)壓力采用Berendsen方法維持在1 atm左右。之后,再將準備好的體系分別進行5 ns NVT 限制性預平衡,使體系中保護劑分子和水分子在阿達木單抗周圍均勻分布。最后,將處理好的體系模型在NVT系綜下進行100 ns常規(guī)分子動力學模擬。對照組以同樣方法模擬,取模擬的最后10 ns軌跡進行數據分析[18]。

    2 ?結果與討論

    2.1 ?不同保護劑對阿達木單抗結構穩(wěn)定性的影響

    均方根偏差[19](Root Mean Square Deviation, RMSD)可以反映特定構想與初始結構的偏離程度,其值越小表明特定構象與初始結構越接近[20]。圖2A為不同體系中阿達木單抗的均方根偏差隨時間變化的均值(RMSD)。從圖2A中可看出,添加了保護劑的阿達木單抗的RMSD值相較于對照組(1.75 nm)有了顯著降低,這表明在干燥狀態(tài)下蔗糖和海藻糖都有效地增強了阿達木單抗活性結構的穩(wěn)定性。但是,由阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的RMSD值分別是0.20 nm和0.22 nm,可以看出,蔗糖比海藻糖保護效果更好。

    回旋半徑[21](Radius of gyration, Rg)的定義為蛋白質結構中每個粒子與體系質心距離的幾何平均值,其值反映了粒子結合的緊密程度,即粒子結合越緊密,Rg越小。圖2B為不同體系中阿達木單抗的回旋半徑(Rg)隨時間變化的均值。從圖2B可知,對照組中阿達木單抗的回旋半徑是3.38 nm。阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的Rg值分別是2.34 nm和2.32 nm??梢?,相較于對照組,海藻糖和蔗糖顯著抑制了阿達木單抗的Rg值的升高,這表明干燥狀態(tài)下阿達木單抗的分子形變得到了抑制。另外,相比于天然初始結構,阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的Rg值較低,這表明干燥狀態(tài)下的阿達木單抗會由于水分的流失發(fā)生塌縮。但是,由阿達木單抗在蔗糖和海藻糖保護下的Rg值可以看出,蔗糖對蛋白質塌縮抑制更好。

    2.2 ?不同保護劑對阿達木單抗相對自由能的影響

    圖3分別展示了干燥狀態(tài)下(參照組)阿達木單抗的相對自由能面圖[22](A)及其相對自由能最低點處阿達木單抗的構象(B)。由圖3A可見,藍色區(qū)域顏色越深,構象落到該區(qū)域概率越大,表明其相對自由能越低,構象越穩(wěn)定。圖3A中局部最小點的相對自由能值為5.04 kT,阿達木單抗在此點的構象如圖3B所示。顯然與天然態(tài)(圖1A)相比, ? ? 在干燥環(huán)境中阿達木單抗構象的二聚體結構發(fā)生分離,兩條鏈往相反的方向拉伸,說明了疏水環(huán) ?境中阿達木單抗無法維持活性結構。疏水作用力作為維持蛋白質結構的主要驅動力[23,24],在極端缺水環(huán)境中,疏水作用力失衡造成阿達木單抗的結構的破壞。

    圖4和圖5分別展示了阿達木單抗分別在蔗糖和海藻糖保護下的相對自由能面圖及其相對自由能最低點處阿達木單抗的構象。在蔗糖和海藻糖保護下阿達木單抗的自由能最小值分別為8.48 kT和8.40 kT。與參照組中阿達木單抗的自由能勢阱5.04 kT相比,蔗糖和海藻糖均有效地提高了阿達木單抗在疏水環(huán)境中的熱穩(wěn)定性。并且在蔗糖和海藻糖保護下的阿達木構象(圖5)與天然態(tài)(圖1A)相比并沒有發(fā)生明顯的變化。這表明蔗糖和海藻糖有效地抑制了干燥狀態(tài)下阿達木單抗雙鏈的分離,穩(wěn)定了蛋白質的三維結構。但是從保護效果來看,依然是蔗糖優(yōu)于海藻糖。

    2.3 ?蔗糖和海藻糖對阿達木單抗親疏水表面的影響

    親疏水表面積指的是蛋白質的親水和疏水殘基的溶劑可及表面積[25],其值越大則殘基在環(huán)境中的暴露面積越大。圖6A為阿達木單抗的時間平均親疏水表面積。從圖6A中可以看出,與天然態(tài)相比,對照組中阿達木單抗的親水表面積顯著降低,與之相反,疏水表面積則發(fā)生劇烈的升高,最終導致親疏水面發(fā)生反轉??梢姼稍锖蟮陌⑦_木單抗分子結構發(fā)生了巨大的形變。此外,在蔗糖和海藻糖體系中阿達木單抗的親水面積均有所降低,但仍高于對照組,而疏水表面積則與天然態(tài)相近。這些結果表明,兩種保護劑均可以有效抑制阿達木單抗疏水殘基的外翻和親水殘基的內卷;但在極端脫水環(huán)境中阿達木單抗分子內的親水相互作用增強,親水表面積收縮。從親疏水表面積變化結果總體評價來看,蔗糖比海藻糖能更好地抑制阿達木單抗在干燥狀態(tài)下活性結構的形變。

    2.4 ?不同保護劑對阿達木單抗二級結構的影響

    無規(guī)則卷曲、β-折疊和α-螺旋是蛋白質構象主要的二級結構。圖6B展示了不同體系中阿達木單抗二級結構在干燥狀態(tài)下的變化情況。從圖6B可知,相較于天然阿達木單抗,對照組中阿達木單抗的無規(guī)則卷曲數目有顯著的升高,而β-折疊和α-螺旋的數量則發(fā)生顯著降低。這表明在干燥環(huán)境中,阿達木單抗的二級結構大量轉變成無規(guī)則卷曲,使得蛋白質的活性結構發(fā)生了較大的改變。α-螺旋有助于提高蛋白質的熱穩(wěn)定性[26,27],隨著干燥環(huán)境中阿達木單抗的α-螺旋的解旋,對照組阿達木單抗的熱穩(wěn)定性降低,與3.2節(jié)的結果相印證。而添加了蔗糖和海藻糖保護的阿達木單抗二級結構的變化則較小,其中蔗糖體系的阿達木單抗的無規(guī)則卷曲、β-折疊以及α-螺旋更接近天然初始狀態(tài),因此蔗糖的保護效果最好。

    2.5 ?保護劑與阿達木單抗相互作用分析

    蔗糖和海藻糖都有效地維持了阿達木單抗在干燥狀態(tài)下的活性結構穩(wěn)定性,但二者的保護效果存在一定的差異。為了探究其原因,我們統(tǒng)計了截斷半徑0.35nm范圍內阿達木單抗與保護劑之間形成的氫鍵數目以及單抗周圍的保護劑數目(圖7A)。結果分析可知,相比于海藻糖,蔗糖吸附在阿達木蛋白質表面的分子數目更多,并且也生成了更多的氫鍵。同時,通過計算聚集在阿達木單抗分子周圍保護劑的溶劑可及表面積(圖7B),可知蔗糖吸附和保護阿達木單抗的表面積更大。綜上說明蔗糖更容易占有阿達木單抗的表面為蛋白質提供更接近水溶劑的氫鍵環(huán)境,從而保護蛋白質結構。

    3 ?結論

    本文利用分子動力學模擬研究了干燥狀態(tài)下蔗糖和海藻糖分別對阿達木單抗活性結構的保護作用。結果表明,阿達木單抗分子因其具有極高柔性在干燥狀態(tài)下會發(fā)生較大的形變導致分子變性失活。本研究中的兩種保護劑可以通過氫鍵作用為干燥狀態(tài)下的阿達木單抗分子提供類似于水溶液中的氫鍵環(huán)境,保護其蛋白質結構,且與海藻糖相比,蔗糖的干燥活性保護作用更好。本研究認為,相較于傳統(tǒng)研究與生產中選擇的海藻糖[28],蔗糖更適合作為阿達木單抗的凍干保護劑[29]。

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