不同保護(hù)劑對纖維分解菌冷凍保存活性的作用

任清長 郁馮艷 付佳偉 華金玲

摘 要：目的：添加甘油、蔗糖、葡萄糖、蛋黃作為纖維分解菌冷凍干燥的保護(hù)劑，篩選最有利于纖維分解菌冷凍干燥保存的保護(hù)劑，為優(yōu)化纖維分解菌冷凍干燥低溫保存保護(hù)劑提供參考。方法：添加甘油、蔗糖、葡萄糖、蛋黃作為4個試驗組，添加量均為10%，每個試驗組3個重復(fù)，同時設(shè)置1個不含保護(hù)劑的空白對照組。預(yù)凍時間設(shè)為12h和24h，采用羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基與稀釋至107級的菌懸液混勻的方法培養(yǎng)冷凍干燥處理前后的纖維分解菌，37℃培養(yǎng)12h，觀察處理前后每個培養(yǎng)皿中單個菌落數(shù)并計數(shù)。結(jié)果：預(yù)凍時間為12h，甘油處理組、空白對照組與蛋黃處理組、葡萄糖處理組、蔗糖處理組間差異極顯著（P<0.01），甘油處理組與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01）;預(yù)凍時間為24h，蔗糖處理與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01），蛋黃處理與蔗糖處理、甘油處理、空白對照組間差異極顯著（P<0.01）。結(jié)論：預(yù)凍時間為12h和24h，均以蛋黃處理組的復(fù)活率最高，不加保護(hù)劑的復(fù)活率最低。隨著預(yù)凍時間的延長，每個不同處理組的復(fù)活率都有所減小。預(yù)凍時間12h，蛋黃處理組的復(fù)活率在試驗中最高，保護(hù)效果最好。

關(guān)鍵詞：纖維分解菌;保護(hù)劑;預(yù)凍時間;復(fù)活率

中圖分類號 S476文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）16-0025-04

Abstract：Objective the purpose of this study is to add glycerol，sucrose，glucose，egg yolk as cellulose decomposition microbes freeze-drying protectant，searching for the most in favor of preservation of cellulose decomposition microbes freeze-drying protectant，to optimize the screening of cellulose decomposition microbes freeze-drying kept at low temperature protective agent to provide the reference.Methods Add glycerol，sucrose，glucose，egg yolk，as four patients，content are all 10%，each group sets three repeats，setting up a blank control group without protective agent，at the same time.prefreezing time set to 12 hours and 24 hours，using sodium carboxymethyl cellulose semisolid culture medium with bacteria suspension diluted to level 107 blending method of training before and after freeze-drying process of cellulose decomposition microbes，developing 12 hours in 37℃.Observe individual colony forming units of each group before and after dealing and count..ResultsUse the semisolid colony counting method to measure the solid medium prefreezing time of 12 hours glycerin treatment group，blank control group with egg yolk treatment group，glucose，sucrose extremely significant difference between groups（P<0.01），glycerin significant difference between treatment group and the blank control group （0.05>P>0.01）.Prefreezing time for 24 hours cane sugar processing and significant difference between the blank control group （0.05>P>0.01），the egg yolk with sucrose，glycerol，and extremely significant difference between the blank control group （P<0.01）.Conclusion Prefreezingtime of 12 hours and 24 hours，the resurrection rate of the egg yolk treatment group is the highest，the resurrection rate without protective agent is the lowest.The resurrection rate of each treatment group decreases with the increasing of the prefreezing time.Prefreezingtime of 12 hours，the resurrection rate of the egg yolk treatment group is the highest in this study.Thus，the protective effect of egg yolk is the best in four protective agents.

Key words：Cellulose decomposition microbes;Protective agent;Prefreezing time;Resurrection rate

秸稈不僅是農(nóng)作物的主要副產(chǎn)品，也是十分寶貴的生物資源[1]，如果不合理利用，將會造成資源浪費，甚至有會造成環(huán)境污染，若利用合理，則變廢為寶，實現(xiàn)秸稈的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境及社會效益[2]。秸稈當(dāng)中所含的主要營養(yǎng)物質(zhì)是粗纖維，由于很難被動物消化，因而主要飼喂牛羊。纖維分解菌分泌的纖維素酶，能夠有效地降解秸稈中的木質(zhì)纖維素并轉(zhuǎn)化成葡萄糖，從而能夠被動物機(jī)體所吸收[3]。將生物活性強(qiáng)的纖維分解菌添加到秸稈當(dāng)中制成發(fā)酵飼料，秸稈就能夠更好地為反芻動物所消化吸收，從而充分地利用了秸稈資源，提高了飼料資源的利用效率，降低環(huán)境污染的程度。但纖維分解菌用于制作秸稈發(fā)酵飼料，也存在著活菌如何長期保存以便發(fā)酵飼料生產(chǎn)的問題。

據(jù)國內(nèi)相關(guān)研究報道，用于保存菌種最有效的方法是真空冷凍干燥法[4]，為了避免菌種在冷凍干燥過程中受冷凍和干燥2種刺激的作用[5]，必須添加有效的保護(hù)劑來承受這2種刺激的損害，降低對菌體細(xì)胞的破壞，而且復(fù)水[6]后還具有較高的降解纖維素的能力。為此，本試驗通過添加蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黃4種不同的保護(hù)劑，研究各自對纖維分解菌冷凍干燥的作用，從而篩選出最有利于纖維分解菌冷凍保存的保護(hù)劑，以期為優(yōu)化纖維分解菌冷凍干燥保存中保護(hù)劑提供參考，為纖維分解菌發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥品及菌種 脫脂乳粉、蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黃、羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基、1株纖維分解菌（實驗室保留的菌種）。

1.2 試驗設(shè)計 添加蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黃4種保護(hù)劑，添加量均為10%，每種保護(hù)劑做3個重復(fù)試驗組，同時設(shè)定1個不加保護(hù)劑的空白對照組。將羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基與處理前后稀釋至107級的1mL菌液稀釋液，在50℃條件下混勻，37℃培養(yǎng)12h，觀察生成的單個菌落數(shù)。用處理后的單個菌落數(shù)除以處理前單個菌落數(shù)的方法計算出每種保護(hù)劑的復(fù)活率，用復(fù)活率值的大小來評價每種保護(hù)劑的作用。

1.3 試驗方法

1.3.1 纖維分解菌的純化、篩選和鑒別 （1）實驗室保留的纖維分解菌經(jīng)初篩后，改用羧甲基纖維素鈉復(fù)篩培養(yǎng)基[7]分離純化，剛果紅培養(yǎng)基鑒別，挑取透明圈內(nèi)的單個菌落，再次接種到復(fù)篩培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。反復(fù)純化過后的菌種經(jīng)革蘭染色，鏡檢觀察，結(jié)果被染成藍(lán)紫色，菌體呈短桿狀，可初步判定為纖維分解菌。（2）纖維分解菌的形態(tài)學(xué)觀察：詳見圖1、圖2。

1.3.2 纖維分解菌菌懸液的制備 （1）脫脂乳的制備：從網(wǎng)上購買進(jìn)口新鮮的脫脂乳粉，按照脫脂乳粉∶蒸餾水=3∶22的比例配成12%的脫脂乳。（2）菌懸液的制備：接種環(huán)挑取3～4個生長良好的纖維分解菌平板，接到100mL滅菌后的脫脂乳中。將接好菌的脫脂乳置于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)搖晃過夜制成生長均勻的菌懸液。

1.3.3 處理前菌懸液活菌數(shù)的測定

1.3.3.1 處理前菌懸液的稀釋 （1）取出振蕩過夜的菌懸液，放在滅菌后的無菌操作臺上，用移液槍分別從菌懸液的上、中、下3層取出10ul菌液。（2）每層取出的菌液均加到裝有10mL生理鹽水的管子中，上下顛倒管子使其混合均勻。再取混合好的稀釋液10ul到另1個10mL生理鹽水管子中，混勻。（3）取混勻后的稀釋液1mL，加到9mL生理鹽水的管子中，混合均勻，將原菌懸液稀釋至107級。

1.3.3.2 羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基 Na2HPO41.25g，KH2PO40.75g，CMC-Na10g，酵母提取物0.25g，蛋白胨1.25g，瓊脂條2.5g，蒸餾水500mL，pH7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.3.3.3 稀釋后菌懸液的接種與培養(yǎng)后菌落計數(shù) （1）移取最終的原菌液稀釋液1mL，加在培養(yǎng)皿底部，輕輕搖晃平皿，讓稀釋液均勻地鋪滿整個培養(yǎng)皿的底部。（2）待半固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃以下時，開始往平皿底部倒入適量半固體培養(yǎng)基。用移液槍的槍頭順時針攪拌使其混合均勻，并防止氣泡產(chǎn)生而影響觀察。混合均勻后，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。（3）觀察培養(yǎng)后的平板中目標(biāo)菌的菌落生長情況，并記錄下每層所生成的單個菌落數(shù)，取其平均值作為處理之前10μL原菌液當(dāng)中的活菌數(shù)。

1.3.4 原菌懸液凍干保護(hù)劑的添加 （1）安瓿管及保護(hù)劑的預(yù)處理：安瓿管先用1%的鹽酸浸泡30min，再用清水洗凈，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min后，置于烘箱中備用。蔗糖、葡萄糖固體藥品按量稱好后開紫外燈殺菌10min，甘油進(jìn)行121℃高壓蒸汽滅菌處理，選用新鮮且無任何病原菌的雞蛋，取出蛋黃打均勻后，開紫外燈殺菌10min。（2）固體保護(hù)劑的添加：稱取預(yù)處理好的蔗糖、葡萄糖各0.05g，移液槍吸取菌液0.5mL，在紫外線照射過的塑料手套上混合后，加入到安瓿管中，并塞進(jìn)滅菌的脫脂棉。（3）液體保護(hù)劑的添加：甘油和蛋黃都取50μL，同上與菌液混合均勻后，加到安瓿管中，塞好脫脂棉。

1.3.5 試樣的冷凍干燥保存 （1）試樣的預(yù)凍處理：裝好保護(hù)劑與菌液的安瓿管試樣，連同不加保護(hù)劑的空白樣共同放在一個無菌的自封袋中，置于-80℃冰箱中做預(yù)凍處理。（2）試樣的冷凍干燥：①冷凍干燥機(jī)用前開機(jī)預(yù)凍30min，待冷肼內(nèi)的溫度達(dá)到-55℃后，將樣品放在物料盤上，加入1支氯化鈷指示劑，蓋好有機(jī)玻璃罩，打開真空泵，進(jìn)行抽真空，時間為18～20h。②待氯化鈷指示劑由紅色變成藍(lán)色時，判定樣品中的水分已干。此時可觀察到樣品已成干粉狀，即關(guān)閉真空泵，關(guān)閉干燥機(jī)電源，打開玻璃罩，將樣品取出。（3）封管：用坩堝鉗夾住安瓿管的球形底部，鑷子夾住管頭，將管子的細(xì)部置于酒精噴燈火焰上。讓其燒斷，并用鑷子夾癟燒斷處，使其成鴨嘴狀便可。（4）保存：封管后的樣品放到-80℃冰箱中，進(jìn)行長期低溫保存。

1.3.6 菌凍干粉的復(fù)活 （1）菌凍干粉的復(fù)活：①將保存在-80℃冰箱中的凍干粉樣品取出，放進(jìn)一個鐵試管架上，在操作臺上靜置5min。②小心地敲碎封管口，用移液槍吸取500μL的滅菌蒸餾水，加入到每支管中，手腕輕輕搖動，直至凍干粉溶解成液態(tài)，達(dá)到凍干前體積。③待所有管子加完蒸餾水后，再次塞好脫脂棉，靜置復(fù)活1～2h。（2）復(fù)活后菌液的稀釋與培養(yǎng)：①用移液槍從每支安瓿管中取出10μL菌液按處理前菌液的稀釋方法進(jìn)行稀釋，最終稀釋好的樣品做好相應(yīng)的標(biāo)記。②按照處理前與羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基混勻的方法對其進(jìn)行接種，待其凝固后倒扣平板，在37℃培養(yǎng)箱中同樣培養(yǎng)12h。③等到培養(yǎng)時間完成，進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察，數(shù)出每個平板當(dāng)中的單個菌落數(shù)，對應(yīng)上每種保護(hù)劑，并做好記錄。（3）根據(jù)下面公式計算出纖維分解菌冷凍干燥后的復(fù)活率：

復(fù)活率（%）=[處理后10μL菌液稀釋培養(yǎng)生成的單個菌落數(shù)處理前10μL菌液稀釋培養(yǎng)生成的單個菌落數(shù)]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Excel和SPASS 19.0軟件進(jìn)行處理，并進(jìn)行Duncan法多重比較。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑對纖維分解菌冷凍干燥的影響 從表1可以看出，當(dāng)預(yù)凍時間為12h，甘油處理組、空白對照組與蛋黃處理組、葡萄糖處理組、蔗糖處理組間差異極顯著（P<0.01），甘油處理組與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01），蛋黃處理組與葡萄糖處理組、蔗糖處理組間差異不顯著（P>0.05）。其中，添加蛋黃處理組的復(fù)活率最高，不加保護(hù)劑處理組的復(fù)活率最低。葡萄糖處理組、蔗糖處理組比蛋黃處理組的復(fù)活率都低13.3%;甘油處理組比蛋黃處理組、葡萄糖處理組、蔗糖處理組的復(fù)活率分別低50.0%、42.4%、42.3%;空白對照組比甘油處理組的復(fù)活率低46.8%，不同處理組間的復(fù)活率由高到低的順序為蛋黃>葡萄糖>蔗糖>甘油>空白對照組。預(yù)凍時間為24h，蛋黃處理與葡萄糖處理組，葡萄糖處理與蔗糖處理、甘油處理組，甘油處理與空白對照組間差異不顯著（P>0.05），蔗糖處理與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01），蛋黃處理與蔗糖處理、甘油處理、空白對照組間差異極顯著（P<0.01）。處理組間仍以蛋黃的復(fù)活率最高，不加保護(hù)劑的最低，且不同處理組間的復(fù)活率由高到低的順序仍與12h的相同。

2.2 預(yù)凍時間對纖維分解菌冷凍干燥的影響 從表1可以看出，蛋黃處理組、甘油處理組預(yù)凍時間12h與24h的復(fù)活率差異不顯著（P>0.05），葡萄糖處理組、空白對照組預(yù)凍時間12h與24h的復(fù)活率差異顯著（0.05>P>0.01），蔗糖處理組預(yù)凍時間12h與24h的復(fù)活率差異極顯著（P<0.01）。24h的蛋黃處理比12h的處理復(fù)活率降低了26.7%，其他處理組24h與12h的復(fù)活率相比均有所降低。其中以蔗糖處理組的復(fù)活率下降最大，24h的復(fù)活率較12h的降低55.9%。

3 討論

3.1 保護(hù)劑 舒志全等研究蛋黃和海藻糖在人類精子冷凍保存中的保存作用時發(fā)現(xiàn)，蛋黃與海藻糖組合作為保護(hù)劑時，能夠?qū)悠鸬礁玫谋Ｗo(hù)作用[8]。蛋黃不僅能減少精子細(xì)胞在預(yù)凍降溫過程中受到的損傷，同時還能作為大分子物質(zhì)，在凍干過程中提供框架結(jié)構(gòu)，形成多孔介質(zhì)。蛋黃作為保護(hù)劑，特別是深低溫冷凍保存中具有極高的保護(hù)作用[9]。試驗預(yù)凍時間12h和24h的不同處理組間，蛋黃作為保護(hù)劑時，其復(fù)活率都是最高的。這可能是由于蛋白質(zhì)作為大分子物質(zhì)，與菌體表面的自由基結(jié)合形成氫鍵以取代水，從而減少了游離水的含量，提高菌液的粘性，減緩了冰晶生長的過程，使冰晶變得細(xì)小，因此就起到了保護(hù)菌體細(xì)胞的作用[10]。脫脂乳粉主要是在細(xì)胞表面起保護(hù)作用，需要和其它類型保護(hù)劑混合使用效果才更好，甘油能夠滲透到細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞壁的通透性降低，從而對細(xì)胞起到很好的保護(hù)作用[11]。試驗脫脂乳的空白對照組在所有的處理組間復(fù)活率最低，預(yù)凍時間12h甘油處理組與空白照組間的復(fù)活率差異顯著（0.05>P>0.01）。此試驗的結(jié)果與相關(guān)研究的規(guī)律基本符合。蒲麗麗等研究中提到糖類物質(zhì)具有大量羥基，能聯(lián)結(jié)菌周圍的自由基團(tuán)，可避免菌暴露在介質(zhì)中[12]。因此，蔗糖處理組與葡萄糖處理組的復(fù)活率都很高，接近40%;這與吳玲等在研究瑞士乳桿菌凍干保護(hù)劑的選擇時，蔗糖處理組的復(fù)活率44%接近，但其葡萄糖處理組的復(fù)活率高達(dá)75%，顯著高于此試驗中葡萄糖處理組的復(fù)活率[13]?？赡苁潜驹囼炘谄咸烟堑奶砑恿可吓c之有所差別，或者是葡萄糖本身的品質(zhì)較差所致。

3.2 預(yù)凍時間 張帆等在對雙歧桿菌凍干菌粉制備工藝的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)預(yù)凍溫度一定時，隨著預(yù)凍時間的增加，細(xì)菌的存活率整體呈下降的趨勢[14]，試驗預(yù)凍時間12h，不同處理組的復(fù)活率都較24h的復(fù)活率高。這可能是因為預(yù)凍時間過長，低溫進(jìn)一步破壞了保護(hù)劑，使得其保護(hù)效果下降。張志平等研究中提到冷凍平衡時間的延長，精子的活力呈下降趨勢，以冷凍前平衡1h為宜[15]，這與試驗結(jié)果基本吻合。Zindl等在冷凍狼精液中發(fā)現(xiàn)，以平衡1h為宜，平衡時間過長會損害精子的完整性[16]。試驗預(yù)凍時間24h各處理組的復(fù)活率要顯著低于12h的，說明預(yù)凍時間不應(yīng)過長，而最佳的預(yù)凍時間可能介于12～24h，或者低于12h。這就需要設(shè)置多個預(yù)凍時間梯度，找出最佳的預(yù)凍時間，從而提高纖維分解菌冷凍干燥的復(fù)活率。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，蛋黃、蔗糖、葡萄糖、甘油4種保護(hù)劑在纖維分解菌冷凍干燥過程中均具有顯著的保護(hù)作用。預(yù)凍時間為12h和24h，均以添加蛋黃處理組的復(fù)活率最高，不加保護(hù)劑處理組的復(fù)活率最低。隨著預(yù)凍時間的延長，各處理組的復(fù)活率均有所下降，其中蔗糖處理組的復(fù)活率下降最顯著。預(yù)凍時間以12h時，蛋黃處理組的復(fù)活效果最好，因此，4種保護(hù)劑中保護(hù)效果最好的是蛋黃。

參考文獻(xiàn)

[1]沙洪林，佟時，張維友，等.我國農(nóng)作物秸稈產(chǎn)生及綜合利用現(xiàn)狀分析[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，35（4）：51-55.

[2]王激清，張寶英，劉社平，等.我國作物秸稈綜合利用現(xiàn)狀及問題分析[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，20（8）：126-128.

[3]蔡燕飛，趙肅清，何成新，等.應(yīng)用纖維素分解菌降解香蕉稈生成可發(fā)酵糖的研究[J].現(xiàn)代化工，2005，25（9）：34-36.

[4]Li Hua，Luo Yaner，Liu Yanlin，et al.Advance in vaccumfree-drying microorgnisms[J].Microbiology，2002，29（3）：78-81.

[5]Sasikoglu H，Ozdemir M，Seker M et al.Freeze-drying of Phamaceutical Products[J].Drying Technology，2006，24（7）：849-861.

[6]潘艷，何勝江.保護(hù)劑對凍干和貯存過程中乳桿菌存活率的影響[J].飼料工業(yè)，2010，31（6）：36-39.

[7]郝月，楊翔華，張晶，等.秸稈纖維素分解菌的分離篩選[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21（7）：58-60.

[8]舒志全，張浩波，張寧，等.海藻糖和蛋黃在人類精子凍干保存中的保護(hù)作用[J].中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報，2007，26（1）：122-125.

[9]Hallak J，Sharma RK，Wellstead C，et al.Cryopreservation of human spermatozoa：Comparison of TEST-yolk buffer and glycerol[J].International Journal of Fertility and Womens Medicine，2000，45（1）：38-42.

[10]曹永梅，張灝，許時嬰，等.保護(hù)劑在冷凍干燥雙歧桿菌中的作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，26（2）：40-44.

[11]張英華，霍貴成，郭鸰.乳酸菌冷凍干燥保護(hù)劑的篩選[J].食品科技，2006（11）：72-75.

[12]蒲麗麗，劉寧.保加利亞乳桿菌凍干保護(hù)劑保護(hù)作用的研究[J].中國釀造，2010（5）：46-48.

[13]吳玲，潘道東，劉海燕.瑞士乳桿菌凍干保護(hù)劑的選擇[J].食品與機(jī)械，2010，26（1）：157-163.

[14]張帆，趙敏，李來酉，等.雙歧桿菌凍干菌粉制備工藝的研究[J].食品科學(xué)，2010，31（15）：221-224.

[15]張志平，張君濤，丁佩佩，等.不同冷凍保護(hù)劑對犬精子凍存的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（2）：122-124.

[16]C.Zindl，C.S.Asa，A.R.Günzel-Apel.Influence of cooling rates and addition of Equex pasta on cooled and frozen-thawed semen of generic gray（Canislupus）and Mexican gray wolves（C. l. baileyi）[J].Theriogenology，2006，66（6-7）：1797-1802.

（責(zé)編：張宏民）