長白山區(qū)核桃青皮多糖分離純化、鑒定及抗氧化活性分析

謝東雪，陸 娟*，王 月，王超雪，陳瑞戰(zhàn)，高佳欣

（長春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130032）

核桃（Juglans regiaL.）青皮是核桃未成熟的果皮[1-2]，核桃收獲期間會得到大量的核桃青皮，但是往往核桃青皮會被作為廢棄材料處理[3]，造成資源的浪費。核桃青皮又稱之為青龍衣，在朝鮮、日本及我國，其作為中藥被廣泛使用，具有清熱解毒、止痛，治療皮膚疾病等作用，同時對癌癥的治療有一定的功效[4-7]，據(jù)文獻報道，青龍衣中含有醌類、萜類、黃酮及多酚等一些小分子的化合物[8-9]，同時也含有多糖等大分子化合物[10]。

多糖是廣泛存在于植物、動物、藻類及微生物中的一類大分子化合物，具有抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]、降血脂[14]、降血糖[15]等多種生物活性。

本實驗以長白山區(qū)產(chǎn)的核桃青皮為主要試材，分離純化超聲輔助提取得到的核桃青皮多糖，并對其結(jié)構(gòu)初步鑒定，對獲得的均一多糖的體外抗氧化活性進行研究，旨在為更好地開發(fā)和利用核桃青皮中的多糖組分及廢棄材料的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮是2015年8月采自于吉林省安圖縣長白山區(qū)，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為核桃青皮，晾干后備用。

DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-100 美國GE Healthcare公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（2,4,6-tripyridyl-strazine，TPTZ）、標(biāo)準品葡聚糖Dextran系列（分子質(zhì)量分別為5 000、1.2×104、2.5×104、5.0×104、8.0×104、2.7×105、4.1×105、6.7×105u）、多種標(biāo)準單糖、VC上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SL-2010N超聲波信號發(fā)生器（最大功率為1 500 W）南京順流儀器有限公司；CP-L200-P250中壓快速純化制備系統(tǒng) 科穗科技（蘇州）有限公司；TU-1900紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備2998 二極管陣列檢測器、2414示差折光檢測器） 美國沃特世公司；Nicolet iS50型紅外光譜儀賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 JPs的提取

稱取核桃青皮粉末200 g，加入20 倍體積的石油醚回流提取2 次，每次2 h，以除去其中色素等脂溶性化合物，濾渣晾干、備用。準確稱量醚提取后的核桃青皮樣品適量，按照料液比1∶50（g/mL）加入蒸餾水，在室溫下浸泡2 h后，利用超聲波輔助提取，提取條件[16]為：超聲功率900 W、提取時間30 min、溫度60 ℃。提取液經(jīng)離心（5 000 r/min，10 min）、減壓濃縮至一定的體積后，加4 倍體積的無水乙醇，靜置于4 ℃冰箱24 h醇沉[17]，沉淀經(jīng)離心（5 000 r/min，15 min）、Sevag法除蛋白[18]，H2O2脫色[19]，利用自來水、蒸餾水各透析24 h后，減壓濃縮，冷凍干燥后得到核桃青皮多糖（polysaccharide of walnult green husks，JPs）。

1.3.2 JPs的分離純化

稱取JPs 200 mg，加入少量蒸餾水中溶解，樣品溶液離心（5 000 r/min，10 min）以除去不溶物，然后將離心液加樣到DEAE Sepharose色譜柱（20 mm×300 mm，10 cm），將色譜柱連接到中壓快速純化制備系統(tǒng)后，分別用蒸餾水及0.1、0.2 mol/L和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，時長240 min，利用試管收集洗脫液（5 mL/管，1 mL/min），用苯酚-硫酸法在490 nm波長處測定洗脫液A值[20]，繪制洗脫管數(shù)與A的關(guān)系曲線。收集單一對稱峰，透析除去NaCl，濃縮后進行冷凍干燥。為了得到足夠的多糖樣品，重復(fù)以上分離操作。

經(jīng)DEAE Sepharose柱色譜分離得到合適組分，加入2 mL蒸餾水，溶解后利用Sephadex G-100色譜柱（10 mm×250 mm，5 cm）分離，以蒸餾水洗脫，收集樣品（5 mL/管，1 mL/min），按照上述方法進行檢測、收集及凍干樣品，得到純化后的多糖樣品。

1.3.3 JPs分子質(zhì)量測定

分離純化得到的JPs分子質(zhì)量采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法測定。色譜條件：Waters Ultrahydrogel 1000（7.8 mm×300 mm，5 μm）、Waters Ultrahydrogel 500（7.8 mm×300 mm，5 μm）、Waters Ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm，5 μm）3 根GPC色譜柱串聯(lián)，2695型HPLC儀，2414示差折光檢測器，流動相為0.1 mol/L的NaNO3，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫35 ℃。測定方法：取Dextran對照品，超純水溶解，制成10 mg/mL的對照品溶液，過濾后，在上述色譜條件下進樣，記錄色譜峰保留時間（tR），以標(biāo)準分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以tR為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。樣品分別以超純水制成10 mg/mL的溶液，在同樣色譜條件下進樣，記錄樣品保留時間，利用標(biāo)準曲線計算樣品分子質(zhì)量。

1.3.4 JPs理化性質(zhì)的測定

JPs總糖含量采用苯酚-硫酸法[21]進行測定，以葡萄糖作為標(biāo)準品，葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）與吸光度A之間的標(biāo)準曲線方程為A=5.341 7C+0.472 7，R2=0.995，線性范圍10～90 mg/mL，依據(jù)標(biāo)準曲線測定多糖樣品中總糖含量；多糖糖醛酸含量的測定采用硫酸-咔唑法[22]，以葡萄糖糖醛酸作為對照品，標(biāo)準曲線方程為y=1.242x-0.088，R2=0.996，線性范圍10～100 μg/mL，依據(jù)標(biāo)準曲線測定樣品中糖醛酸含量；以牛血清白蛋白作為標(biāo)準對照品，采用考馬斯亮藍法[23]，蛋白質(zhì)標(biāo)準曲線方程為y=0.000 6x-0.004 3，R2=0.997，線性范圍10～100 μg/mL，依據(jù)標(biāo)準曲線測定多糖中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.5 JPs單糖組成分析

準確稱取分離得到的均一多糖樣品10 mg置于反應(yīng)釜中，加入2 mol/L的H2SO42 mL，待樣品完全溶解，充氮氣、密封置于95 ℃烘箱中水解8 h后，取出反應(yīng)釜冷卻至室溫，分別向水解液中加入6 mol/L NaOH溶液使樣品呈中性，加超純水定容至2 mL。分別準確移取上述樣品500 μL，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液和200 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，待樣品充分溶解后，充氮氣密封，在70 ℃水浴中放置30 min。再分別向樣品溶液中加入約150 μL 0.5 mol/L HCl溶液使樣品呈中性，然后再分別加入1 mL氯仿萃取，反復(fù)萃取3～5 次，棄去氯仿層，上層水溶液過0.45 μm水系濾膜，待HPLC分析。

分別準確稱取單糖標(biāo)準品10 mg，制成5 mg/mL的標(biāo)準品水溶液，分別取上述標(biāo)準品溶液200 μL，按照樣品的單糖衍生化操作進行HPLC分析。

H P L C色譜條件： Ve n u s i l M P C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相：pH 6.86磷酸緩沖溶液-乙腈（83∶17，V/V），流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

1.3.6 JPs紅外光譜的測定

稱取樣品1.5 mg，置于瑪瑙研缽中，加入適量干燥KBr粉末，研磨混合，壓片后測定紅外光譜，掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.7 JPs抗氧化活性分析

JPs總抗氧化能力（ferric-reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）及DPPH、羥自由基清除實驗均參照課題組已有方法進行[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 JPs提取、分離與純化

核桃青皮經(jīng)石油醚除脂、超聲波輔助提取、乙醇醇沉、除蛋白、除色素、透析凍干等一系列處理后，得到JPs 15.78 g，提取率為7.89%。

JPs經(jīng)DEAE Sepharose色譜柱分離，以水和0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，在水洗和0.1 mol/L NaCl溶液洗脫部分得到2 個明顯主峰，洗脫曲線見圖1a，分別合并命名為JPs-1、JPs-2。

JPs-1、JPs-2繼續(xù)經(jīng)Sephadex G-100色譜柱純化，洗脫曲線見圖1b、c，可以看出JPs-1，JPs-2經(jīng)純化后均得到一個對稱峰，合并濃縮、透析、凍干得到淡黃色粉末，分別命名為JPs-1-1、JPs-2-1。

2.2 核桃青皮分子質(zhì)量測定及理化性質(zhì)

利用HPGPC法測定JPs-1-1、JPs-1-2分子質(zhì)量，色譜圖見圖2，根據(jù)葡聚糖Dextran系列得到回歸方程為：lgmw=-0.154 2tR+9.098 7，R2=0.915。根據(jù)保留時間計算出JPs-1-1、JPs-2-1的分子質(zhì)量為5.45×104、5.22×104u。

圖2 JPs-1-1（a）、JPs-1-2（b）的HPGPC色譜圖Fig. 2 HPGPC chromatograms of JPs-1-1 (a) and JPs-1-2 (b)

利用苯酚-硫酸法測定JPs-1-1、JPs-2-1的總糖質(zhì)量分數(shù)分別為89.78%、89.46%；利用硫酸-咔唑法測定的其糖醛酸質(zhì)量分數(shù)分別為6.62%、8.82%；蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果顯示，JPs-1-1、JPs-2-1均不含有蛋白質(zhì)。具體結(jié)果見表1。

表1 JPs理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of JPS-1-1 and JPS-2-1

2.3 JPs的單糖組成分析

JPs-1-1、JPs-2-1經(jīng)2 mol/L的H2SO4水解成單糖，經(jīng)PMP衍生氯仿萃取后，樣品直接進入HPLC進行分析，與標(biāo)準單糖PMP衍生后的保留時間進行對比，結(jié)果見圖3、表1，結(jié)果表明，JPs-1-1主要是由Rha、GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara組成，其物質(zhì)的量比為2.25∶19.26∶2.05∶43.35∶3.36∶21.03∶8.90；JPs-2-1同樣是由Rha、GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara七種單糖組成，物質(zhì)的量比為1.95∶13.25∶0.97∶32.35∶15.91∶24.73∶10.48；JPs-2-1糖醛酸的含量高于JPs-1-1。

圖3 混合標(biāo)準單糖（a）和JPs-1-1（b）、JPs-2-1（c）酸水解后HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of mixture of monosaccharide standards (a) and monosaccharides released from acid-hydrolyzed JPS-1-1 (b) and JPS-2-1 (c)

2.4 JPs紅外光譜分析

圖4 JPS-1-1（a）與JPS-2-1（b）紅外光譜圖Fig. 4 IR spectra of JPS-1-1 (a) and JPS-2-1 (b)

由圖4可知，位于3 380 cm-1附近（3 389、3 400 cm-1）處的吸收峰為O—H伸縮振動，位于2 930 cm-1附近（2 934、2 934 cm-1）處的吸收峰C—H伸縮振動與變角振動，位于1 700 cm-1（1 703、1 714 cm-1）可歸屬為糖醛酸結(jié)構(gòu)中的C＝O的伸縮振動、1 600 cm-1附近的吸收峰（1 622 、1 618 cm-1）可能是羰基的C＝O伸縮振動，說明該化合物可能含有糖醛酸[25]。位于1 400 cm-1附近的吸收峰（1 448、1 416 cm-1）為C—H的變角振動，位于1 100 cm-1（1 142 cm-1、1 147 cm-1）和1 032 cm-1（1 035、1 071 cm-1）的吸收峰為C—O—C或C—O—H的變角振動[26]，位于879、889 cm-1的吸收峰說明多糖含β-糖苷鍵[27]。綜上，以上吸收峰的存在說明JPs-1-1和JPs-2-1均具有多糖化合物的特征吸收[28]。

2.5 JPs體外抗氧化活性分析

圖5 JPs體外抗氧化活性結(jié)果Fig. 5 In vitro antioxidant activities of JPs and its fractions

JPs及分離純化得到的均一多糖JPs-1-1、JPs-2-1具有較強的抗氧化活性。由圖5a可以看出，在質(zhì)量濃度為0.1～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，3 種多糖的FRAP值與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)依賴關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，且JPs增加趨勢明顯高于JPs-1-1和JPs-2-1，但低于VC。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，JPs、JPs-1-1、JPs-2-1和VC的FRAP值分別為（955.3±21.2）、（855.6±21.3）、（905.3±19.9）μmol/L和（1 086.5±16.4）μmol/L。JPs多糖FRAP較高的原因可能是未分離純化多糖中含有多酚、色素等一些具有抗氧化活性的小分子物質(zhì)。

由圖5b可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品質(zhì)量濃度越大，清除能力越強，四者清除能力大小順序為VC＞JPs＞JPs-1-1＞JPs-2-1，JPs、JPs-1-1、JPs-2-1清除羥自由基的IC50分別為0.23、0.38 mg/mL和0.48 mg/mL。

由圖5c可知，在0.1～3.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品具有較強的清除DPPH自由基的能力。3 種多糖中JPs-2-1清除能力最強，清除DPPH自由基的IC50為0.31 mg/mL，JPs清除能力次之，清除DPPH自由基的IC50為0.32 mg/mL，JPs-1-1清除能力最低，清除DPPH自由基的IC50為0.40 mg/mL。

有研究結(jié)果表明多糖的抗氧化活性可能與多糖分子質(zhì)量有關(guān)，分子質(zhì)量越低，抗氧化活性可能越強；多糖抗氧化活性也可能與多糖的結(jié)構(gòu)有關(guān)，如—COOH、—OH等基團的存在也可能增大多糖的抗氧化能力[29]，JPs分離純化得到的兩種均一多糖中，JPs-2-1的抗氧化能力要明顯高于JPs-1-1，這可能是由于JPs-2-1的分子質(zhì)量低于JPs-1-1，且含有較多的糖醛酸。

3 結(jié) 論

利用超聲波輔助提取法、經(jīng)過醇沉、除蛋白、除色素、透析、冷凍干燥后得到JPs。JPs先后經(jīng)DEAE Sepharose、Sephadex G-100柱色譜分離純化得到JPs-1-1和JPs-2-1兩種均一多糖，總糖含量分別為89.78%、89.46%，糖醛酸含量分別為6.62%、8.82%，均不含蛋白質(zhì)；兩種均一多糖均是由Rha、GlcA、Gal、Glc、GalA、Xyl和Ara七種單糖以不同的物質(zhì)的量比組成，分子質(zhì)量分別為5.45×104、5.22×104u。體外抗氧化活性結(jié)果顯示，3 種多糖均具有較強的抗氧化活性，均能清除羥自由基和DPPH自由基，且清除能力與樣品質(zhì)量濃度呈現(xiàn)依賴關(guān)系。本研究可為核桃青皮廢棄物進一步研究及開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。