姚月鳳,王家勤,滑金杰,許 琦,3,張銘銘,江用文,袁海波,*,董春旺,李 佳,*
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,浙江省茶葉加工工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310008;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081;3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北 武漢 430068)
工夫紅茶是我國(guó)的傳統(tǒng)紅茶,以其外形優(yōu)美、高氣香銳、滋味鮮醇、湯色紅艷的品質(zhì)特點(diǎn)而享譽(yù)國(guó)內(nèi)外[1-2]。茶湯滋味是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要因子之一,在茶葉感官審評(píng)中占比30%[3]。相比非發(fā)酵茶,工夫紅茶由于其獨(dú)特的發(fā)酵工藝呈現(xiàn)出更為豐富、多元的滋味特點(diǎn)[4]。其中,“甜純”滋味是高等級(jí)工夫紅茶的關(guān)鍵品質(zhì)特征之一[3],能降低茶湯的苦味、澀味等感官滋味,提高工夫紅茶的適口性。因此,建立工夫紅茶甜純滋味特征的客觀、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)體系,進(jìn)而深入研究甜純滋味的關(guān)鍵呈味物質(zhì)及其呈味特性,對(duì)工夫紅茶的品質(zhì)評(píng)價(jià)和提升具有重要意義。
目前茶湯滋味評(píng)價(jià)的主流手段是專家感官審評(píng),該方法依賴于審評(píng)員的感官和經(jīng)驗(yàn),容易受到主觀因素和外界環(huán)境的影響,重復(fù)性較差,一定程度上限制了茶葉滋味的深入研究。電子舌技術(shù)是一種新興的基于模擬味覺(jué)傳感器的人工味覺(jué)識(shí)別技術(shù),其原理是多個(gè)不同的味覺(jué)傳感器對(duì)所測(cè)茶湯中不同組分的響應(yīng)各異,從而獲得代表茶湯滋味特點(diǎn)的整體“指紋”信息[5]。目前,電子舌已廣泛地應(yīng)用于食品[6-8]、醫(yī)藥[9-11]、環(huán)境[12-14]等多個(gè)研究領(lǐng)域。采用電子舌分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)法在茶葉品質(zhì)研究領(lǐng)域已有諸多應(yīng)用,如,成功用于CTC紅茶的質(zhì)量評(píng)價(jià)[15]、不同綠茶等級(jí)的鑒定[16]等。值得注意的是,在茶湯滋味品質(zhì)的研究中,采用電子舌實(shí)現(xiàn)了對(duì)綠茶鮮味[17]、紅茶和烏龍茶的苦味、澀味的客觀評(píng)價(jià)[18]。然而,相比上述苦、澀、鮮等滋味屬性,紅茶茶湯中的甜味屬性強(qiáng)度相對(duì)較低[19],這也給甜純滋味的客觀評(píng)價(jià)帶來(lái)一定難度?,F(xiàn)有基于電子舌的茶湯滋味研究主要集中于強(qiáng)度較高的滋味屬性,目前鮮見(jiàn)紅茶甜純滋味屬性的研究,也鮮見(jiàn)工夫紅茶甜純滋味的客觀評(píng)價(jià)體系的相關(guān)報(bào)道。因此,發(fā)展基于電子舌的甜純滋味的客觀評(píng)價(jià)方法具有重要意義。
基于此,本實(shí)驗(yàn)以專家感官審評(píng)為依據(jù),圍繞甜純滋味特征,對(duì)不同工夫紅茶茶湯開(kāi)展電子舌分析并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)手段,探索基于電子舌的甜純滋味客觀判別模型,以期為后續(xù)工夫紅茶甜純滋味特征的深入研究提供理論依據(jù)。
本研究包含實(shí)驗(yàn)集和驗(yàn)證集2 部分工夫紅茶茶樣。研究目的是建立基于電子舌的工夫紅茶甜純滋味評(píng)價(jià)方法,因此根據(jù)專家感官審評(píng)得到的滋味特征納入茶樣。實(shí)驗(yàn)集中共納入16 個(gè)工夫紅茶茶樣。其中4 個(gè)茶樣在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所制作,均以一芽二葉福鼎大白為原料,經(jīng)萎調(diào)、揉捻、發(fā)酵、干燥等工夫紅茶加工工序制成,其中發(fā)酵工藝參數(shù)略有不同(靜態(tài)發(fā)酵、不同轉(zhuǎn)速的滾動(dòng)發(fā)酵),其余為商品茶。驗(yàn)證集中共納入14 個(gè)工夫紅茶茶樣,均為商品茶。
法國(guó)Alpha-MOS公司生產(chǎn)的ASTREE電子舌系統(tǒng),該系統(tǒng)包括Alphasoft V12控制及化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件、16 位自動(dòng)進(jìn)樣器、第5套傳感器(SRS(酸)、SWS(甜)、BRS(苦)、STS(咸)、UMS(鮮)和2 根復(fù)合味覺(jué)傳感器GPS、SPS))及一個(gè)氯化鋁參比電極。
1.3.1 感官審評(píng)
取300 g茶樣置于評(píng)茶盤中,把盤,待茶葉混勻后,用大拇指、食指、中指抓取上中下3 段茶樣,稱?。?.00±0.01)g,置于審評(píng)杯中,待沸水水溫冷卻到85 ℃,向?qū)徳u(píng)杯中注滿水,加蓋,沖泡茶樣4 min后將茶湯瀝入審評(píng)杯碗[20]。冷卻至(50±2)℃后,由感官審評(píng)小組人員進(jìn)行感官審評(píng)。感官審評(píng)小組由5 位(3 男2 女)具有高級(jí)評(píng)茶員及以上資質(zhì)的審評(píng)人員組成。
1.3.2 電子舌數(shù)據(jù)采集
用1.3.1節(jié)方法進(jìn)行茶樣沖泡,茶湯趁熱過(guò)4 層紗布(150 目×10 目)倒入審評(píng)碗,冷卻至室溫(25±2)℃,待分析。每個(gè)茶樣沖泡2 次作為重復(fù)。
數(shù)據(jù)采集前,對(duì)電子舌進(jìn)行傳感器活化、校準(zhǔn)、診斷等操作,以確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性與穩(wěn)定性。將80 mL茶湯置于容量為100 mL的電子舌專用燒杯中,樣品采集與清洗交替進(jìn)行。茶湯采集時(shí)間為120 s,清洗(純水)時(shí)間為10 s,每秒采集1 個(gè)數(shù)據(jù)。每個(gè)茶湯樣品重復(fù)測(cè)定6 次,選取后4 次穩(wěn)定的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析,每次選定110~120 s時(shí)間段內(nèi)穩(wěn)定響應(yīng)信號(hào)的平均值作為輸出值。計(jì)算2 次沖泡電子舌響應(yīng)值的平均值,每個(gè)茶樣保留電子舌的4 次測(cè)量數(shù)據(jù)。檢測(cè)的環(huán)境溫度為(25±2)℃。
統(tǒng)計(jì)分析采用SIMCA-P+11軟件(Umetrics,瑞典)進(jìn)行主成分分析(principal components analysis,PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squaresdiscrimination analysis,PLS-DA);采用SPSS 18(IBM,美國(guó))進(jìn)行單因素方差分析、二元邏輯回歸分析。
根據(jù)專家人工感官審評(píng),將茶湯滋味定義為“甜純”、“純正”和“欠純”3 類進(jìn)行后續(xù)分析。“甜純”定義為茶湯優(yōu)勢(shì)滋味屬性為甜純、有回甘或甘和?!凹冋弊涛秳t指味道純正、無(wú)明顯雜味?!扒芳儭弊涛抖x為含有明顯的陳、酸、澀或悶味等不愉快的滋味。根據(jù)茶湯滋味特點(diǎn)的差異,將實(shí)驗(yàn)集16 個(gè)工夫紅茶分類。其中甜純組、純正組和欠純組分別包含7、5 個(gè)和4 個(gè)茶樣(表1)。
表1 實(shí)驗(yàn)集工夫紅茶茶樣感官審評(píng)結(jié)果及組別Table 1 Taste sensory evaluation and classification of Congou black tea samples in experimental set
為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性和穩(wěn)定性,從甜純組、純正組、欠純組中分別任意選取一個(gè)茶樣A、B、C,均沖泡3 次,按1.3.2節(jié)進(jìn)行電子舌數(shù)據(jù)的采集。如表2所示,7 個(gè)傳感器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=12)在0.09%~4.38%之間,顯示茶湯沖泡和電子舌檢測(cè)的重復(fù)性良好。
表2 電子舌7 個(gè)傳感器響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 RSD of responses of seven sensors%
為了快速、直觀地分析電子舌對(duì)不同滋味特征(甜純、純和、欠純)工夫紅茶茶湯的響應(yīng)差異,首先采用PCA對(duì)電子舌數(shù)據(jù)進(jìn)行總覽。PCA是一種基于數(shù)據(jù)降維的非監(jiān)督多變量統(tǒng)計(jì)分析手段,可客觀地反映原始變量的信息并進(jìn)行線性分類[21]。如圖1A所示,PC1為83.35%,PC2為11.93%,前2 個(gè)主成分代表了樣本中95.28%的信息,表明PCA模型可以綜合反映電子舌數(shù)據(jù)。3 類不同滋味的工夫紅茶茶湯在PCA得分圖上得到較為明顯的區(qū)分。甜純組與純正組、欠純組茶湯存在顯著差異,在PC1方向上分開(kāi)(PC1=83.35%);而純正組與欠純組間差異則相對(duì)較小,在PC2方向上得到區(qū)分(PC2=11.93%)。盡管感官審評(píng)表明12#茶樣的主要滋味屬性為甜純,然而由于其稍帶煙味,顯著影響了電子舌的響應(yīng)“指紋”,使得12#茶樣在圖1A上遠(yuǎn)離其他甜純組的樣品而接近純正組與欠純組的茶樣。類似地,甜純組14#茶樣由于其滋味“稍帶果味”也在圖1A上較遠(yuǎn)離其他甜純組茶樣。上述結(jié)果表明,電子舌分析可基本客觀地反映不同的茶湯滋味。然而,對(duì)個(gè)別滋味屬性較為復(fù)雜的樣本,電子舌分析所識(shí)別的滋味特點(diǎn)與人工感官仍有一定差別。紅茶茶湯中成分眾多,互作復(fù)雜。電子舌的味覺(jué)傳感器陣列由選擇性各異的一系列傳感器所組成,傳感器的數(shù)量有限,難以完全模擬人類味蕾[22]。12#茶樣在人工感官審評(píng)中為“甜純,稍帶煙”,優(yōu)勢(shì)滋味為甜純;而傳感器顯示其滋味為非甜(純正或欠純),其原因可能是,相比人工感官,傳感器可能對(duì)茶湯中煙味分子較為敏感。因此在后期大規(guī)模樣本的建模研究中,應(yīng)以科學(xué)的感官審評(píng)為依據(jù),對(duì)“稍帶煙”的茶樣建立更加嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)進(jìn)一步明確該類茶樣的電子舌響應(yīng)規(guī)律,從而提高模型準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
為探索電子舌檢測(cè)能否用于工夫紅茶茶湯滋味的判別,以電子舌7 個(gè)傳感器響應(yīng)值為X變量,以茶湯滋味分組(甜純、純正、欠純)為Y變量做PLS-DA。PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法,相對(duì)于PCA所得的投影通??色@得更好的分類效果[23]。如圖1B所示,3 類(甜純、純正、純)茶湯的聚類結(jié)果類似于PCA的結(jié)果(R2X=1,R2Y=0.61,Q2=0.512)。Q2大于0.5,表明模型具有較好的預(yù)測(cè)能力[24]。過(guò)擬合是PLS-DA模型的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題[25]。為進(jìn)一步驗(yàn)證PLS-DA模型的可靠性,對(duì)該模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)驗(yàn)證(圖1C)。將模型建立時(shí)定義的Y矩陣的變量隨機(jī)排列100 次,得到R2和Q2截距分別為(0.0,0.029)和(0.0,-0.399),表明PLS-DA模型穩(wěn)定可靠,未存在過(guò)擬合,可用于不同滋味的判別。
圖1 實(shí)驗(yàn)集甜純、純正、欠純3 類工夫紅茶茶湯電子舌響應(yīng)值的PCA得分圖(A)、PLS-DA得分圖(B)和置換檢驗(yàn)圖(C)Fig. 1 PCA score plot (A) and PLS-DA score plot (B) for electronic tongue analysis of Congou black tea infusions with three different taste characteristics in experimental set and cross-validation of PLS-DA model (C)
為進(jìn)一步探明電子舌7 根傳感器的響應(yīng)值對(duì)滋味分組的貢獻(xiàn),篩選出影響甜純滋味識(shí)別的關(guān)鍵傳感器,將上述PLS-DA模型做載荷分析。如圖2所示,對(duì)甜純滋味識(shí)別影響較大的變量可能為SWS(甜)、UMS(鮮)、SPS(綜合),其w×c值分別為0.47、0.42、0.42,以變量SWS(甜)貢獻(xiàn)為最大。進(jìn)一步采用變量投影重要性(variable important for the projection,VIP)篩選關(guān)鍵差異變量,如圖3所示。結(jié)果表明,VIP值大于1.0的變量包括SWS(甜)、GPS和SPS(復(fù)合味覺(jué))及BRS(苦),其中以SWS(甜)的VIP值為最高。SWS甜味傳感器對(duì)甜純組茶湯的響應(yīng)顯著高于純正組和欠純組(P<0.001),而對(duì)于純正組和欠純組的響應(yīng)差異則不顯著(圖4)。上述結(jié)果表明SWS甜味傳感器可能是識(shí)別甜純滋味的關(guān)鍵因子。
電子舌傳感器陣列中包含的多個(gè)傳感器不是單一物質(zhì)味覺(jué)敏感傳感器,每根傳感器對(duì)多種物質(zhì)具有交互的味覺(jué)敏感性但靈敏度各異[5],推測(cè)SWS傳感器可能對(duì)工夫紅茶茶湯中的甜純特征的呈味物質(zhì)靈敏度較高,而對(duì)苦、澀類物質(zhì)的靈敏度較低。目前鮮見(jiàn)工夫紅茶茶湯中甜味物質(zhì)的研究報(bào)道。對(duì)大吉嶺紅茶等其他茶葉的研究揭示葡萄糖、蔗糖、丙氨酸、鳥氨酸、茶氨酸、茶黃素等具有甜味的滋味特點(diǎn)[19,26-27]。電子舌傳感器陣列對(duì)工夫紅茶茶湯中組分的響應(yīng)規(guī)律,及工夫紅茶的甜純特征成分仍有待研究。
圖2 PLS-DA因子載荷圖Fig. 2 Loading plot of PLS-DA model
圖3 實(shí)驗(yàn)集3 類(甜純、純正、欠純)茶湯的電子舌綜合響應(yīng)PLS-DA的VIP圖Fig. 3 VIP plot of PLS-DA model
圖4 電子舌SWS甜味傳感器對(duì)3 類(甜純、純正、欠純)工夫紅茶茶湯的響應(yīng)柱狀圖Fig. 4 Bar plot of signal responses of SWS sensors to tea infusions with three different taste characteristics in experimental set
為實(shí)現(xiàn)對(duì)工夫紅茶茶湯滋味甜純與否的快速、準(zhǔn)確判別,對(duì)電子舌7 個(gè)傳感器響應(yīng)值的數(shù)據(jù)進(jìn)行二元邏輯回歸分析,以篩選關(guān)鍵判別因子并建立判別方程。采用“向前逐步選擇法”僅篩選出1 個(gè)建立最優(yōu)預(yù)測(cè)模型所需的變量,為SWS(甜),驗(yàn)證了PLS-DA載荷分析和VIP值的結(jié)果。基于此,建立判別預(yù)測(cè)方程為(p為預(yù)測(cè)甜純滋味的概率;X為SWS甜味傳感器響應(yīng)值)。p值大于0.5表示樣品預(yù)測(cè)為甜純組;反之則為非甜純的茶湯(純正或欠純)。如圖5所示,基于該預(yù)測(cè)方程,非甜純茶湯的滋味歸屬均預(yù)測(cè)正確,甜純茶湯中除了12#茶樣外均預(yù)測(cè)正確,預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為93.8%。12#茶樣由于其滋味“甜純,稍帶煙”,顯著影響了電子舌的響應(yīng),被預(yù)測(cè)為非甜純的茶湯,與PCA和PLS-DA結(jié)果一致。剔除該異常樣本后,預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%。
圖5 基于二元邏輯回歸分析預(yù)測(cè)的茶湯滋味歸屬的預(yù)測(cè)概率散點(diǎn)圖Fig. 5 Scatter plot for predicted probability of tea taste assignment using binary logistic regression analysis
為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)集的結(jié)果,收集14 個(gè)工夫紅茶作為驗(yàn)證集進(jìn)行專家感官審評(píng)和電子舌分析。如表3所示,甜純、純正和欠純組分別包含4、5、5 個(gè)茶樣。
甜純、純正和欠純3 類茶湯的電子舌“指紋”在PCA得分圖(PC1=50.40%,PC2=30.67%)上各自展現(xiàn)出清晰的聚類(圖6A),表明電子舌傳感器對(duì)甜純、純正和欠純3 類茶湯中溶液分子的響應(yīng)存在顯著差異。進(jìn)一步地,PLS-DA模型也可實(shí)現(xiàn)對(duì)驗(yàn)證集中3 類不同滋味工夫紅茶的有效判別(圖6B)。模型R2X=0.869,R2Y=0.922,Q2=0.914,表明PLS-DA模型在驗(yàn)證集樣本中具有良好的預(yù)測(cè)能力。置換檢驗(yàn)驗(yàn)證(100 次置換檢驗(yàn))結(jié)果顯示,R2和Q2截距分別為(0.0,0.006 73)和(0.0,-0.35),表明模型穩(wěn)健、未存在過(guò)擬合現(xiàn)象(圖6C)。進(jìn)而對(duì)模型分組貢獻(xiàn)最大的關(guān)鍵變量為SWS甜味傳感器(圖6D)。驗(yàn)證集的多變量分析結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)集得出的結(jié)論一致,再次證明了電子舌可用于工夫紅茶甜純滋味特征的快速檢測(cè)和識(shí)別。
表3 驗(yàn)證集工夫紅茶茶樣感官審評(píng)結(jié)果及組別Table 3 Taste sensory evaluation and assignments of Congou black tea samples in validation set
圖6 驗(yàn)證集甜純、純正、欠純?nèi)惞し蚣t茶茶湯電子舌響應(yīng)值的PCA得分圖(A)、PLS-DA得分圖(B)、置換檢驗(yàn)圖(C)和PLS-DA因子載荷圖(D)Fig. 6 PCA score plot (A) and PLS-DA score plot (B) for electronic tongue analysis of Congou black tea infusions with three different taste characteristics in validation set, cross-validation of PLS-DA model (C),and loading plot of PLS-DA model (D)
本研究圍繞高品質(zhì)工夫紅茶的甜純滋味特征,以專家感官審評(píng)為依據(jù),開(kāi)展基于電子舌的茶湯甜純特征的客觀評(píng)價(jià)研究。結(jié)果表明,利用電子舌的響應(yīng)“指紋”結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析手段,可實(shí)現(xiàn)對(duì)工夫紅茶甜純滋味的客觀、有效判別。電子舌中的SWS甜味傳感器是甜純滋味判別的關(guān)鍵因子。基于二元邏輯回歸建立的甜純滋味判別方程,預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)93%以上。因此,本研究提供了一種基于電子舌的工夫紅茶甜純滋味特征的快速、準(zhǔn)確的判別評(píng)價(jià)手段,可作為專家感官審評(píng)的輔助或補(bǔ)充,亦可為茶湯滋味的客觀、智能評(píng)價(jià)提供依據(jù)?;诒狙芯浚钊胙芯侩娮由鄠鞲衅麝嚵袑?duì)工夫紅茶復(fù)雜茶湯組分的響應(yīng)機(jī)制,探索工夫紅茶甜純滋味的物質(zhì)基礎(chǔ),對(duì)于工夫紅茶滋味品質(zhì)的提升和調(diào)控具有積極的意義。