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    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定干紅葡萄酒中18 種花色素單體方法的建立

    2019-10-08 03:49:00楊志偉王圣儀王昶森張進(jìn)杰張軍翔
    食品科學(xué) 2019年18期
    關(guān)鍵詞:花色素離子源紅葡萄酒

    金 剛,楊志偉,王圣儀,王昶森,馬 雯,張進(jìn)杰,張 昂,*,張軍翔,*

    (1.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川 750021;2.葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏葡萄與葡萄酒研究院,寧夏葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,寧夏 銀川 750021;3.秦皇島出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,河北 秦皇島 066004)

    花色素是葡萄果皮的重要次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化的作用,針對老年病有著特殊的功效[1],在抗糖尿病、預(yù)防老年癡呆、抗高血壓、抗炎、保護(hù)血管、動脈,抗突變、抗腫瘤[2-3]和癌癥等方面效果顯著[4]?;ㄉ仉S著葡萄酒釀制過程中的果實處理浸入干紅葡萄酒,是干紅葡萄酒中主要呈色物質(zhì),常以糖苷形式存在,使其呈現(xiàn)出不同顏色,對葡萄酒顏色與顏色的穩(wěn)定性造成影響[5-6]。同時干紅葡萄酒中花色素的組成特征同樣包含品種產(chǎn)地、年份以及釀酒工藝、栽培方式、生態(tài)條件、陳釀時間等信息[7-8],可以作為區(qū)分不同品種干紅葡萄酒的化學(xué)標(biāo)志,因此鑒定干紅葡萄酒中花色素的種類和含量對葡萄酒真?zhèn)舞b別及等級評定起重要作用。

    花色素按照結(jié)構(gòu)可分為基本花色苷、?;ㄉ?、吡喃花色苷、聚合花色苷4 類[9-12],其中基本花色苷主要有五錦葵花色素苷、芍藥花色素苷、矢車菊花色素苷、飛燕草花色素苷和矮牽?;ㄉ剀? 種形式[13],分屬5 種糖苷配基。研究表明[14],葡萄主要含有5 種花色素,分別為花青素(矢車菊素)、花翠素(飛燕草素)、3’-甲花翠素(矮牽牛素)、青甲?;ù渌兀ㄉ炙幩兀┖投谆ù渌兀ㄥ\葵素),以錦葵色素占主要比例,種類和含量根據(jù)葡萄所屬種和品種的不同而有所變化。在此基礎(chǔ)上,本實驗共整理出共18 種常見花色素單體作為干紅葡萄酒中檢測項。

    目前國內(nèi)關(guān)于花色素的研究多為分離純化,對快速定量檢測研究較少,常見檢測方法包括pH示差法[15]、分光光度計法、液相色譜(liquid chromatography,LC)技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜[16-20](high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)技術(shù)等,蔣寶等[21]以晉西黃土高原地區(qū)4 個品種的干紅葡萄酒為研究對象,利用HPLC-MS對多種聚合花色苷及衍生物成分進(jìn)行分析,僅以二甲花翠素葡萄糖苷做內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行了定量分析;季梅等[22]通過HPLC-全波長紫外掃描-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對葡萄皮中花色苷進(jìn)行檢測,檢測的基本花色苷種類較少且未定量檢測;He Fei等[23]對歐亞種葡萄酒花色苷種類的檢測,利用HPLC-MS技術(shù)在葡萄酒樣品中共檢出36 種花色苷類物質(zhì),未定量測定;Violeta等[24]利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)鑒定花色苷結(jié)構(gòu),未進(jìn)行定量檢測。

    干紅葡萄酒中利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技術(shù)測定基礎(chǔ)花色苷單體及含量的研究鮮有報道,UPLC-MS/MS技術(shù)可以在HPLC-MS的基礎(chǔ)上進(jìn)行2 次質(zhì)量數(shù)篩選,盡可能降低背景噪音,提高檢測靈敏度,使定量更為準(zhǔn)確,以縮短檢測時間、分離能力強(qiáng)等優(yōu)點迅速發(fā)展[25-26]。本實驗采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立定性定量分析干紅葡萄酒中18 種花色素單體及含量的方法,以期為產(chǎn)地干紅葡萄酒相應(yīng)溯源標(biāo)準(zhǔn)的制定提供新思路,為干紅葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)和質(zhì)量檢測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    秦皇島市售120 種干紅葡萄酒。

    18 種花色素單體標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%):飛燕草色素(delphinidin,Del)、飛燕草素-3-葡萄糖苷(delphinidin-3-glucoside,Del-3-G)、飛燕草素-3,5-二葡萄糖苷(delphinidin-3,5-diglucoside,Del-3,5-D)、飛燕草素鼠李葡萄糖苷(delphinidin-3-O-rutinoside,Del-3-R)、矢車菊素(cyanidin,Cya)、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside,Cya-3-G)、矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷(cyanidin-3,5-diglucoside,Cya-3,5-D)、天竺葵色素苷(pelargonin,Pel)、天竺葵素(pelargonidin,Pel-3-gal)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(pelargonidin-3-O-glucoside,Pel-3-G)、芍藥素(peonidin,Peo)、芍藥苷-3-O-葡萄糖苷(peonidin-3-O-glucoside,Peo-3-G)、芍藥素-3,5-二葡萄糖苷(peonidin-3,5-di-O-glucoside,Peo-3,5-D)、錦葵色素(malvidin,Mal)、錦葵色素-3,5-二葡萄糖苷(malvidin-3,5-diglucoside,Mal-3,5-D)、錦葵色素-3-半乳糖苷(malvidin-3-galactoside,Mal-3-G)、矮牽牛素(petunidin,Pet)、矮牽牛素-3-D-葡萄糖苷(petunidin-3-O-β-D-glucoside,Pet-3-G)美國Extrasynthese SA公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    30A UPLC儀 日本島津公司;SCIEX QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源、Turbo V離子源和Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 美國AB Sciex公司;Phenyl-Hexyl色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm) 美國Waters公司;Milli-Q去離子水機(jī) 美國Millipore公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品前處理

    取1 mL干紅葡萄酒樣,用含5%甲醇的1%甲酸溶液稀釋500 倍,渦旋混合后吸取1 mL移至樣品瓶,為減少目標(biāo)物損失,未過濾膜。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液配制

    分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中,用含5%甲醇的1%甲酸溶液溶解并定容至刻度,搖勻,制得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃避光保存。

    1.3.3 基質(zhì)液配制

    將150 mL乙醇和3 g酒石酸移入1 L的容量瓶中,用去離子水定容,得到模擬酒樣,使用時取出適量模擬酒樣,再加入目標(biāo)濃度的花色素單體的單標(biāo)或混標(biāo)使用。

    1.3.4 UPLC條件

    柱溫40 ℃,進(jìn)樣體積30 μL,流速0.25 mL/min,用Phenyl-Hexyl色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)分離,根據(jù)花色素單體性質(zhì)確定流動相A為含5%甲醇的1%甲酸溶液,流動相B為1%甲酸-甲醇溶液。洗脫程序:0~3.1 min,0%~65% B;3.1~8.0 min,65% B;8.0~8.5 min,65%~100% B;8.5~12.5 min,100% B;12.5~13 min,100%~0% B;13~20 min,0% B。

    1.3.5 MS條件

    電霧噴離子源,正離子模式;反應(yīng)監(jiān)測;離子掃描范圍m/z100~1 000;霧化器壓力345 kPa;輔助氣流速10 L/min;干燥氣溫度350 ℃;氣簾氣壓力30 psi;碰撞氣Mediun;離子噴霧電壓5 500 V;離子源溫度500 ℃。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

    采用注射泵直接將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源的方式對18 種花色素單體質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。分別將質(zhì)量濃度為1 mg/L的18 種花色素單體標(biāo)準(zhǔn)工作液以10 μL/min流速注入離子源中,電霧噴離子源,正離子模式模式下對每種花色素單體進(jìn)行一級質(zhì)譜分析,對碰撞室射出電壓和去簇電壓進(jìn)行充分優(yōu)化,以確定準(zhǔn)分子離子峰。再進(jìn)行目標(biāo)離子二級掃描,優(yōu)化碰撞電壓,得到碎片離子。

    分別選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高、碎片結(jié)構(gòu)合理的2 個子離子作為定量和定性離子,確定其最佳碰撞能量。

    2.2 色譜條件優(yōu)化

    為提高花色素單體的離子化效率[27],選擇含5%甲醇的0.5%~1.5%甲酸溶液作為流動相同時分析18 種花色素單體的峰形,確定在添加1%甲酸溶液時花色素單體的峰形最好,但保留時間基本相同,分離效果差。

    在電霧噴離子源,正離子模式下,18 種花色素單體的質(zhì)譜參數(shù)見表1,分子結(jié)構(gòu)式見圖1,總離子流圖見圖2。

    表1 18 種花色素單體質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 18 anthocyanin monomers

    由表1和圖1、2可知,優(yōu)化后的18 種花色苷單體總離子流圖出峰響應(yīng)值高、靈敏度高、峰形標(biāo)準(zhǔn),但這18 種花色素單體由于結(jié)構(gòu)極性相近,在色譜柱上無法得到分離,色譜柱僅起到將干擾物與待測物分離的作用,因此可以通過不同質(zhì)譜信息對這18 種花色素單體進(jìn)行鑒定和含量計算。

    圖1 18 種花色素單體分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecular structures of 18 anthocyanidic monomers

    圖2 18 種花色素單體總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of 18 anthocyanidic monomers

    2.3 線性關(guān)系、檢出限及定量限測定結(jié)果

    向1.3.4節(jié)模擬酒基質(zhì)液中定量添加18 種花色素單體的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別在0.00、1.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μg/L 8 個水平下測定,以目標(biāo)化合物的峰面積(y)對其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照1.3.5節(jié)樣品前處理方法制備干紅葡萄酒樣品,平行6 次實驗,分別在10.0、20.0、50.0 μg/L添加水平進(jìn)行添加,計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,按3 倍信噪比得到目標(biāo)化合物的檢出限,10 倍信噪比得到目標(biāo)化合物的定量限,結(jié)果見表2。從表2可以看出,線性回歸系數(shù)R2均大于0.999,說明該種方法測定18 種花色素單體在1~500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,為減小誤差,在實際樣品檢測時可根據(jù)實際情況取其中一段線性進(jìn)行定量。在低、中、高的添加水平范圍內(nèi),18 種花色素單體回收率均在95%以上,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于3%,說明上述樣品預(yù)處理方法可行,可以滿足日常樣品分析要求。

    表2 方法學(xué)驗證Table 2 Methodological verification

    2.4 實際樣品檢測

    表3 實際樣品中花色素的測定結(jié)果(n=120)Table 3 Summary of analytical results for the determination of anthocyanins in real samples by the proposed method (n= 120)

    為判定該方法的普遍性,對秦皇島市售120 種干紅葡萄酒進(jìn)行測定,測定結(jié)果見表3,根據(jù)已檢測花色素單體在干紅葡萄酒中含量,繪制含量箱線圖,見圖3。

    由表3可知,120 種干紅葡萄酒中共檢出16 種花色素單體,未檢出的花色苷單體為Pel-3-gal和Pel-3-G,花色苷單體總量在15 000~60 000 μg/L之間。干紅葡萄酒中花色苷含量從高到低排序為Mal、Mal-3-G、Del-3-G、Del、Mal-3,5-D、Peo-3-G、Peo、Del-3,5-D、Cya、Del-3-R、Pet、Peo-3,5-D、Pet-3-G、Cya-3-G、Cya-3,5-D、Pel。

    圖3 干紅葡萄酒中花色素單體的含量分布Fig. 3 Distribution of anthocyanin monomers in wine

    由圖3可知,16 種檢出花色素單體含量的中位數(shù)位置、四分位間距框的位置與高度基本相同,說明數(shù)據(jù)具有良好的對稱性,正常值分布比較集中,從16 種花色素單體含量的Whisker上限和下限看,Mal和Mal-3-G在紅葡萄酒中含量分布范圍很廣。

    李琪等[28]利用HPLC技術(shù)測定甘肅地區(qū)9 種釀酒葡萄中花色素單體含量,認(rèn)為錦葵色素為釀酒葡萄中含量最高的花色素單體,與本實驗結(jié)論相同;張世杰等[29]利用HPLC技術(shù)同樣得到錦葵色素是干紅葡萄酒中主要花色素單體。

    本實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致,并在此基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)另外2 種在干紅葡萄酒中含量較高的花色素單體,為Mal-3-G以及Del-3-G。Mal、Mal-3-G和Del-3-G在干紅葡萄酒中分別占花色素單體總量的31.01%、24.50%和12.22%,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[24]可知Mal在歐亞種釀酒葡萄釀制的干紅葡萄酒中含量約占50%,Mal-3-G在山葡萄釀制的紅葡萄酒中含量較高,由此可以推測,120 種市售干紅葡萄酒有部分葡萄酒在釀制過程中加入山葡萄釀造。

    3 結(jié) 論

    本實驗采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立干紅葡萄酒中18 種花色素單體定性定量的檢測方法,通過儀器條件、稀釋液和流動相、色譜柱的優(yōu)化,最終得到方法的檢出限在0.2~3.5 μg/L之間,定量限在0.4~11.5 μg/L之間,加標(biāo)回收率在95%~100%之間。

    這種檢測方法操作簡便、靈敏度高、實用性強(qiáng),相比于已有方法[30],檢測時間短且檢出限低,經(jīng)方法學(xué)驗證,該方法能滿足干紅葡萄酒中18 種花色素單體的日常檢測要求,可應(yīng)用于干紅葡萄酒日常監(jiān)測工作。

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