1 株裂解性短尾沙門氏菌噬菌體T139的生物學特性及其對牛奶和牛肉的抑菌作用

聶若男，李晚寧，楊其樂，王小紅，王 佳*

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

沙門氏菌（Salmonella）是一種常見的革蘭氏陰性細菌，屬于腸桿菌科，在許多發(fā)達國家和發(fā)展中國家是引起食源性細菌感染的重要原因之一[1]。沙門氏菌作為最常見的食源性病原體之一，每年約導致9 380萬 例食源性疾病和155 000 人死亡[2]。大多數(shù)沙門氏菌的感染主要是由于食用了被沙門氏菌污染的食物，主要來源于家禽、蛋和乳制品中，新鮮的水果、蔬菜也逐漸成為傳播沙門氏菌的途徑之一[3-4]。感染沙門氏菌的可能癥狀包括腹瀉、發(fā)燒、腹部絞痛、惡心、偶爾嘔吐和頭痛，并且通常在食用后12～72 h出現(xiàn)并持續(xù)4～7 d[5]。因此，一直以來，沙門氏菌受到全世界各國的廣泛關注。特別是隨著人類抗生素的濫用，隨即產(chǎn)生了多重耐藥病原菌甚至產(chǎn)生超級細菌，食源性病原菌耐藥性問題越來越嚴重[6]。因此，對于食源性病原菌的控制除傳統(tǒng)的抗生素之外，必須開發(fā)新的治療策略，其中策略之一就是使用噬菌體[7]。

噬菌體是自然界中最豐富的生物之一，在地球上大約蘊藏著1031的噬菌體顆粒，也就是平均每1 g土壤或水中包含了多達108數(shù)量的噬菌體，長期以來一直被認為可以用作治療藥物和殺菌劑[8]。噬菌體對某些細菌菌株具有高度特異性，不會影響生物體或內(nèi)源性組織的正常運轉(zhuǎn)，另外，即使隨著細菌耐藥性的發(fā)展，噬菌體仍會大量保持[9]。過去幾年中，使用噬菌體來抑制食物中的腐敗細菌和病原體的生長受到越來越多研究者的關注，并且該方法已有許多研究支持。例如在蜜瓜切片[10]、雞胸肉、白菜、牛奶[11]、雞皮[12]、豆芽菜[13]等食品中發(fā)現(xiàn)使用噬菌體制劑后沙門氏菌菌量顯著減少。另外，已從多種食物如碎牛肉[14]、豬肉等肉制品[15]、奶制品[16]、生菜[17]等分離出沙門氏菌噬菌體，因此，噬菌體是食品中的天然微生物。

本研究以鼠傷寒沙門氏菌為宿主菌從下水道污水中分離純化得到1 株烈性噬菌體，通過實驗研究其形態(tài)、宿主范圍、一步生長曲線、吸附速率、最佳感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）以及溫度和酸堿穩(wěn)定性等基本的生物學特性，并評估易被沙門氏菌污染的食品中利用噬菌體控制鼠傷寒沙門氏菌的潛力和功效，為制備噬菌體抗菌劑抑制沙門氏菌污染提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuriumATCC 13311）以及其他測定宿主譜所用菌株均為實驗室保存菌種；污水樣品來自于湖北省武漢市某下水道。

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、大豆蛋白瓊脂（trypticase soy agar，TSA）、瓊脂 青島高科園海博生物技術有限公司；0.22 μm微孔濾膜德國Millipore公司；脫脂乳粉 美國BD-Difco公司。

雙層瓊脂培養(yǎng)基：下層培養(yǎng)基為固體TSA培養(yǎng)基、上層培養(yǎng)基為半固體TSB培養(yǎng)基+0.7%瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

5417R小型臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Allegra X-30R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；BSO-130011A2超凈臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HNY-2102C全溫振蕩培養(yǎng)箱武漢瑞華儀器設備有限責任公司；YX 600W高壓滅菌鍋上海三申醫(yī)療器械有限公司；WH-2微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司；M200 PRO酶標儀瑞士Tecan公司；7000FA100 KV透射電子顯微鏡 日本日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體的分離和純化

1.3.1.1 宿主菌株的復蘇與培養(yǎng)

挑取鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311單菌落接種于10 mL TSB液體培養(yǎng)基中，160 r/min、37 ℃搖床中培養(yǎng)8 h。再按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接到裝有10 mL新鮮的TSB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)液用稀釋涂平板法進行計數(shù)，備用。細菌數(shù)量按式（1）計算：

1.3.1.2 噬菌體的分離純化及效價測定

參照蔡天舒等[18]的方法進行改進，使用雙層平板法進行噬菌體的分離和純化。取來自湖北省武漢市某下水道的污水，使用濾紙過濾后，離心并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，取5 mL濾液與2.5 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311及10 mL TSB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，混合培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后即得到噬菌體原液。采用雙層平板的方法進行噬菌體的純化，操作如下：取100 μL合適梯度噬菌體液、100 μL宿主菌和4 mL半固體培養(yǎng)基混合倒于TSA下層平板上，待凝固后于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h左右，使用白槍頭挑取大小一致的典型噬菌斑于1 mL TSB培養(yǎng)基中，加入100 μL生長至對數(shù)期的鼠傷寒沙門氏菌，37 ℃條件下培養(yǎng)12～18 h，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，得上清液。單一噬菌斑反復純化3～5 次直至噬菌斑大小基本一致即得到純化的噬菌體。

將純化后的噬菌體原液進行10 倍梯度稀釋，取合適梯度的稀釋液100 μL與100 μL宿主菌混合，加入4 mL溫熱的培養(yǎng)基倒雙層平板，37 ℃培養(yǎng)6 h，按式（2）計算噬菌體效價：

1.3.2 噬菌體的生物學特性

1.3.2.1 噬菌體形態(tài)觀察

采用磷鎢酸負染色法[19]，取20 μL高效價噬菌體液和20 μL體積分數(shù)2%、pH 7的磷鎢酸分別滴加在封口膜上。輕取銅網(wǎng)，先浸沒于噬菌體液中10 min之后用濾紙吸去多余液體。再將銅網(wǎng)置于磷鎢酸染料中染色10 min后吸去多余液體，自然晾干至完全干燥，制備好的銅網(wǎng)在透射電子顯微鏡下觀察噬菌體形態(tài)，并用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量其大小。

1.3.2.2 噬菌體宿主譜測定

采用點樣法進行宿主譜的測定。取100 μL培養(yǎng)至對數(shù)期的標準菌株加入到溫熱的半固體培養(yǎng)基中，混勻后倒入預先制備好的TSA平板上，待凝固后，取5 μL效價109PFU/mL的噬菌體滴加至上層平板表面，干燥后置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，觀察裂解情況。

1.3.2.3 噬菌體最佳MOI測定

MOI指初始感染時噬菌體數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值。按一定的MOI值（0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000）將噬菌體與宿主菌混合，37 ℃培養(yǎng)3.5 h，11 000 r/min離心10 min，用雙層平板法測定不同MOI值樣品中上清液的噬菌體效價。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.2.4 噬菌體吸附速率

按最適MOI值將新鮮噬菌體液與宿主菌懸液混合于離心管中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)。從0 min開始，每隔2 min采用雙層平板法測定上清液中噬菌體效價。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.2.5 噬菌體一步生長曲線

1.3.2.6 噬菌體熱穩(wěn)定性

將噬菌體原液稀釋至106PFU/mL，并分裝于1 mL無菌離心管中，將離心管分別放置于30、40、50、60、70、80 ℃的恒溫水浴鍋中，0、30 min和 60 min時測定各管中噬菌體的效價。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.2.7 噬菌體pH值穩(wěn)定性

取已知效價的噬菌體懸液（107PFU/mL）100 μL加入到900 μL不同pH值（2～13）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，將其置于37 ℃水浴鍋2 h后測定各離心管中噬菌體的效價。實驗重復3 次，每次設2 個平行。

1.3.2.8 噬菌體對宿主菌的裂解曲線

噬菌體分別按照MOI為100、10、1、0.1、0.01、0.001，各取100 μL加入96 孔板中，并加入100 μL 107CFU/mL的沙門氏菌菌液。另設陰性對照組加入200 μL TSB培養(yǎng)基；陽性對照組加入100 μL 107CFU/mL的沙門氏菌菌液和100 μL TSB培養(yǎng)基。每隔1 h測定600 nm波長處的OD值，共測定10 h。

1.3.3 噬菌體在牛奶和牛肉中的抑菌實驗

1.3.3.1 噬菌體在牛奶中的應用

1.3 文獻篩選及資料提取 由2位研究者獨立進行文獻篩選和資料提取，并交叉核對，如意見分歧，則討論解決或交由第三位研究者裁決，缺乏的資料應盡量與原作者聯(lián)系予以補充。文獻篩選是首先閱讀標題，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀摘要和全文，以確定最終是否納入研究。資料提取內(nèi)容包括：①納入研究的基本信息，包括作者、發(fā)表時間、文獻來源等；②研究對象干預措施的具體細節(jié)；③偏倚風險評價的關鍵要素；④結(jié)局指標和測量結(jié)果數(shù)據(jù)。

參照Huang Chenxi等[20]的方法并進行改進，使用產(chǎn)自美國的新鮮脫脂牛奶，并根據(jù)制造商的說明進行滅菌。在接種10 μL鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311（106CFU/mL）的牛奶中加入MOI=10和MOI=100的相應噬菌體100 μL，在對照組牛奶中加入等體積的PBS，將樣品在4 ℃或25 ℃溫育。溫育0、1、3、6、9 h和12 h后，取出等分試樣通過連續(xù)平板稀釋法進行細菌計數(shù)（CFU/mL）。實驗重復2 次，每次設2 個平行。運用Graphpad Prism軟件進行繪圖和分析，實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行鄧肯氏差異分析方法分析（P＜0.05，差異顯著）。

1.3.3.2 噬菌體在牛肉中的應用

參照Huang Chenxi等[20]的方法將在超市購買的新鮮牛肉使用無菌刀切成特定尺寸（直徑1 cm，厚度0.5 cm）并置于無菌培養(yǎng)皿中。紫外照射牛肉樣品正反面各0.5 h后確保無菌。在牛肉丁上接種10 μL鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311（106CFU/mL），將樣品置于安全柜中干燥15～20 min，然后按照MOI=10和MOI=100加入噬菌體10 μL并在對照組的牛肉丁中加入等體積的PBS，置于4 ℃或25 ℃溫育。在溫育0、1、3、6、9 h和12 h后取樣，將牛肉丁加入到5 mL無菌緩沖溶液中，使用研磨棒充分研磨，并在99 W超聲波清洗器中清洗樣品5 min，以獲得勻漿樣品，通過連續(xù)平板稀釋法進行細菌計數(shù)（CFU/mL）。實驗重復2 次，每次設2 個平行。運用Graphpad Prism軟件進行繪圖和分析，實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行Duncan差異分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化及效價測定

圖1 噬菌體T139的噬菌斑形態(tài)Fig. 1 Bacteriophage plaques of T139

如圖1所示，通過雙層平板法經(jīng)過5 次純化后，噬菌體T139所形成的噬菌斑形態(tài)和大小保持均勻一致，呈圓形透明狀態(tài)，直徑約為6 mm，其原液效價高達109PFU/mL。

2.2 噬菌體的生物學特性

2.2.1 噬菌體形態(tài)

圖2 噬菌體T139的透射電子顯微電鏡圖Fig. 2 TEM micrograph of T139

噬菌體T139高濃度裂解液經(jīng)過透射電子顯微鏡觀察，如圖2所示，該噬菌體具有直徑為（43±1）nm的二十面體頭部，長（11±0.6）nm的非收縮性尾部，符合短尾噬菌體科特征，因此鑒定噬菌體T139為短尾噬菌體。

2.2.2 噬菌體宿主譜

采用點樣法測定噬菌體的宿主范圍，由表1可見，噬菌體T139不能裂解大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌和副溶血弧菌，只能裂解沙門氏菌屬，說明噬菌體T139僅對沙門氏菌屬具有特異性。并且噬菌體T139能夠裂解鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、都柏林沙門氏菌和阿哥拉沙門氏菌等部分耐藥菌株，說明噬菌體T139宿主譜較為廣泛并且能裂解部分從肉制品中分離的耐藥菌株。

表1 噬菌體T139的宿主范圍Table 1 Host range of phage T139

2.2.3 噬菌體最佳MOI

表2 噬菌體T139的最佳MOI測定結(jié)果Table 2 Determination of optimal multiplicity of infection (MOI)

由表2可知，噬菌體T139在MOI為0.001時，噬菌體效價最高為1.24×1010PFU/mL，因此噬菌體T139的最佳MOI為0.001。

2.2.4 噬菌體吸附速率

圖3 噬菌體T139的吸附速率Fig. 3 Adsorption rate of phage T139

由圖3可知，噬菌體T139在6 min時吸附速率達到最大，約66%，且噬菌體T139與宿主菌作用12 min后開始釋放子代噬菌體。

2.2.5 噬菌體一步生長曲線

圖4 噬菌體T139的一步生長曲線Fig. 4 One step growth curve of phage T139

由圖4可知，噬菌體T139在前5 min曲線趨勢保持平穩(wěn)，即判斷噬菌體T139的潛伏期為5 min，之后噬菌體的效價急劇增加，在70 min之后逐漸保持平穩(wěn)，即判斷噬菌體爆發(fā)期為60 min。裂解量為裂解末期噬菌體效價與感染初期宿主菌菌量之比，得出噬菌體T139的裂解量為54.54 PFU/cell。

2.2.6 噬菌體熱穩(wěn)定性

圖5 噬菌體的熱穩(wěn)定性Fig. 5 Thermal sensitivity of phage T139

由圖5可知，噬菌體在30～50 ℃以內(nèi)活性保持穩(wěn)定，在60 ℃和70 ℃時噬菌體T139活性大約減少一半，在高溫80 ℃時基本失活。由此可知，噬菌體T139對高溫耐受性較差，適合在50 ℃及以下環(huán)境中生存。

2.2.7 噬菌體pH值穩(wěn)定性

圖6 噬菌體的pH值穩(wěn)定性Fig. 6 pH sensitivity of phage T139

由圖6可知，噬菌體T139在pH 4～12范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定，說明該噬菌體對酸堿的耐受力較強；而pH值低于4或者大于12時噬菌體基本失活。由此可知，噬菌體T139的最適pH值范圍為4～12。

2.2.8 噬菌體對宿主菌的裂解曲線

圖7 噬菌體T139在不同MOI值下裂解宿主菌的曲線Fig. 7 Time-course curves of host cell lysis by phage T139 with different MOIs

如圖7所示，與未加噬菌體T139的陽性對照相比，噬菌體T139在7 h內(nèi)不同MOI值下都可以抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長，在7 h后曲線開始有所上升，說明宿主菌沒有被完全殺死且菌量有所上升。并且陽性對照組曲線與沙門菌正常的生長曲線相符。實驗結(jié)果表明噬菌體T139對宿主菌有較強裂解作用，但不能完全殺死宿主菌。因此該結(jié)果為噬菌體T139的抑菌實驗提供依據(jù)。

2.3 噬菌在牛奶和牛肉中的抑菌實驗

2.3.1 噬菌體在牛奶中的抑菌作用

圖8 4 ℃（A）和25 ℃（B）噬菌體在牛奶中的抑菌效果（MOI=10和MOI=100）Fig. 8 Inactivation of S. typhimurium in milk by T139 with MOI of 10 and 100 at 4 ℃ (A) and 25 ℃ (B)

由圖8A可知，4 ℃時，對照組的鼠傷寒沙門氏菌菌量12 h內(nèi)一直處于與初始菌量相當?shù)臓顟B(tài)，實驗組在按照MOI=10和MOI=100加入噬菌體的情況下，沙門氏菌菌量并沒有顯著降低。由圖8B可知，25 ℃時，對照組鼠傷寒沙門氏菌從初始菌量3.57（lg（CFU/mL）），經(jīng)過12 h增加到8.20（lg（CFU/mL）），而實驗組在按照MOI=10和MOI=100加入噬菌體的情況下，沙門氏菌菌量從6 h開始顯著降低，至最終12 h，相比于對照組MOI=10和MOI=100時分別下降4.32（lg（CFU/mL））和4.27（lg（CFU/mL）），抑菌效果非常明顯。

2.3.2 噬菌體在牛肉中的抑菌作用

圖9 4 ℃（A）和25 ℃（B）噬菌體在牛肉中的抑菌效果（MOI=10和MOI=100）Fig. 9 Inactivation of S. typhimurium in beef by T139 with MOI of 10 and 100 at 4 ℃ (A) and 25 ℃ (B)

由圖9A可知，4 ℃時，對照組鼠傷寒沙門氏菌菌量在12 h內(nèi)一直處于與初始菌量相當?shù)臓顟B(tài)，實驗組在按照MOI=10加入噬菌體的情況下，沙門氏菌菌量并沒有顯著下降；但是按照MOI=100加入噬菌體時，3 h后沙門氏菌菌量有顯著下降，最終相比于對照組下降0.66（lg（CFU/mL））。由圖9B可知，25 ℃時，對照組鼠傷寒沙門氏菌菌量在12 h內(nèi)只是略有增加，實驗組在按照MOI=10加入噬菌體的情況下，沙門氏菌菌量從3 h開始有顯著下降，相比與對照組下降0.77（lg（CFU/mL））；在按照MOI=100加入噬菌體時，1 h后沙門氏菌菌量已開始有顯著下降，最終相比于對照組下降1.16（lg（CFU/mL）），抑菌效果明顯。

3 討 論

沙門氏菌一直以來都是導致人類食源性疾病發(fā)生的重要病原微生物之一。在引起感染的20余種沙門氏菌不同血清型中，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌占27.9%[21]?？咕鷦├缁瘜W藥物或化學殺菌劑可以減少或消除微生物，被認為是減少沙門氏菌污染的最有效方法。然而，持續(xù)使用抗菌藥物已經(jīng)產(chǎn)生了某些副作用，例如食品中抗生素殘留物和多藥耐藥性沙門氏菌菌株的出現(xiàn)，如鼠傷寒沙門氏菌DT104[22]。因此，新的生態(tài)友好型策略用作抗沙門氏菌的生物防治劑隨即出現(xiàn)[11]。近年來，噬菌體由于其優(yōu)良特性而受到了新的關注，例如具有靶標特異性但不損害共存的微生物群落、固有的低毒性、對惡劣環(huán)境的穩(wěn)健性、廣泛分布性和自我復制以及相對便宜和易生產(chǎn)等優(yōu)勢[23-25]。本研究在實驗室從污水中分離出1 株裂解性鼠傷寒沙門氏菌噬菌體，并對其生物學特性進行了全面研究。同時，測定了該噬菌體對于牛奶和牛肉中沙門氏菌的抑菌效果，為該噬菌體作為抗菌劑奠定了實驗基礎并提供理論依據(jù)。

本研究分離得到的噬菌體屬于有尾噬菌體目，短尾噬菌體科。目前已從不同的環(huán)境和食品中分離出幾千種針對不同靶標的噬菌體，其中，長尾噬菌體科是最豐富的，占噬菌體總量的61.6%；其次是具有收縮性尾巴的肌尾噬菌體科占24.5%；而短尾噬菌體科只占14.9%[26]。而本研究篩選到的噬菌體T139是短尾噬菌體。該噬菌體在良好的培養(yǎng)條件下與宿主菌接觸12 min內(nèi)就能完成吸附并產(chǎn)生噬菌體后代，潛伏期短只有5 min，噬菌體的溫度耐受性在50 ℃以內(nèi)，酸堿耐受性在pH 4～12，這與Jung等[27]研究中噬菌體P22-B1及P22的溫度及酸堿耐受性一致，這種耐受性為噬菌體制劑的生產(chǎn)以及滅活提供了便利。

噬菌體T139應用于牛奶的抑菌實驗中，在4 ℃時并沒有顯著抑制效果，這是因為低溫是噬菌體感染力低的原因之一，低溫阻礙了微生物的生長，而噬菌體依賴于其宿主的繁殖[20]。然而，當在25 ℃時，在以MOI=10和MOI=100加入噬菌體時，沙門氏菌菌量分別下降4.32（lg（CFU/mL））和 4.27（lg（CFU/mL）），殺菌率達到了50%以上。噬菌體T139在牛奶中25 ℃時殺菌效果好，這可能是因為在牛奶這樣的液體食品基質(zhì)中，流動性較好，噬菌體能夠更充分地接觸到宿主菌而將其殺滅。Bao Hongduo等[11]在25 ℃時將噬菌體vB_SenMPA13076按照MOI=10 000加入沙門氏菌污染的牛奶中時，作用5 h后菌量降低了約2 個數(shù)量級，這與本研究中噬菌體T139作用效果相當，但其使用的MOI值較高。噬菌體T139應用于牛肉中時，在4 ℃時以MOI=100加入噬菌體時沙門氏菌菌量下降了0.66（lg（CFU/mL））；25 ℃時，噬菌體以MOI=10或MOI=100加入時，沙門氏菌菌量分別下降了0.77（lg（CFU/mL））和1.16（lg（CFU/mL）），具有一定的抑菌效果，且在MOI=100時抑菌效果比MOI=10時抑菌效果強。Liu Hui等[28]研究4 株大腸桿菌噬菌體分別在各自不同MOI下對大腸桿菌的抑菌效果，其中3 株噬菌體均在高MOI下即MOI=1 000時抑菌效果更強，因此，本研究為達到更好的抑菌效果，可以在未來的研究中提高MOI（1 000或10 000）加強抑菌效果。該噬菌體T139作為一種天然抗菌劑，表現(xiàn)出了較強的溫度穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性以及在低MOI即MOI=10和MOI=100時對鼠傷寒沙門氏菌較好的抑制作用，因此可以用來控制食品中沙門氏菌的污染，為該噬菌體作為抗菌劑的應用提供了實驗依據(jù)。