牛乳αS1-酪蛋白與大豆蛋白交叉過敏原的識別鑒定

叢艷君，呂曉哲，李 曄，劉 迪，李鄰峰

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，

食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京友誼醫(yī)院皮膚科，北京 100050）

世界糧農(nóng)組織1995年報告，90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、甲殼類動物、花生、大豆、堅(jiān)果類和小麥引起。一些過敏患者對某種食物過敏，然后食用其他同源食物或非同源食物也可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為食物的交叉過敏，但是與同源食物發(fā)生過敏的頻率及強(qiáng)度顯著高于非同源食物，比如牛乳與其他動物乳類、蝦和貝殼海產(chǎn)品，花生和其他豆類食物等[1-3]。食物交叉過敏的普遍性和復(fù)雜性增加了食物過敏發(fā)生的概率，同時增加了建立精準(zhǔn)高效的過敏原定量檢測方法及開發(fā)低過敏食品的難度。過敏原的交叉反應(yīng)研究一直是食品過敏學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題，識別鑒定交叉過敏原，分析其結(jié)構(gòu)與致敏特性的關(guān)系，對于過敏原檢測、診斷以及過敏原脫敏疫苗設(shè)計(jì)，指導(dǎo)過敏患者合理飲食，開發(fā)新型低過敏食品，合理有效避免交叉過敏反應(yīng)發(fā)生均具有重要的意義。

每100 mL牛乳約含有3 g蛋白質(zhì)，包含至少25 種不同的蛋白質(zhì)，是嬰幼兒最理想的母乳替代品，但是牛乳中這些蛋白質(zhì)都可能是潛在的過敏原[4]，研究表明，酪蛋白中的4 種組分是主要過敏原，并且αS1-酪蛋白的致敏性要強(qiáng)于αS2-、β-、κ-酪蛋白[5-6]。大豆蛋白質(zhì)的氨基酸組成平衡合理，可以提供嬰幼兒正常的生長和免疫需求，并且成本低，適口性好，因此大豆蛋白質(zhì)也被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品中。通常將大豆種子中的過敏原蛋白可分為5 大類，Gly m 5（β-伴大豆球蛋白）、Gly m Bd 30K/P34、Gly m Bd 28K/P28、Gly m 6（大豆球蛋白）和Gly m Ti（胰蛋白酶抑制劑）[7]。本課題組前期系統(tǒng)研究了牛乳主要過敏原αS1-酪蛋白的作用表位及關(guān)鍵氨基酸[8]，而牛乳αS1-酪蛋白與大豆蛋白中的致敏蛋白是否存在交叉過敏反應(yīng)是本研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

本研究以牛乳過敏嬰幼兒血清、αS1-酪蛋白單克隆抗體為探針，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)識別鑒定大豆蛋白質(zhì)交叉過敏原，并通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列比對，驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最后深入探究了交叉過敏原的消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αS1-酪蛋白 美國Sigma公司；αS1-酪蛋白單克隆抗體 實(shí)驗(yàn)室自制；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 北京天根生物科技有限公司；HRP-鼠抗人IgE、HRP-羊抗小鼠IgG北京友誼中聯(lián)生物技術(shù)有限公司；大豆分離蛋白 上海源葉生物科技有限公司；96 孔酶標(biāo)板 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 美國密理博公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KHB ST-360酶標(biāo)儀 上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；DYY-7C型電泳儀、電熱恒溫水浴鍋 北京市六一儀器廠；SH-2磁力攪拌器 北京東方開物科學(xué)器材公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳過敏患者血清的收集

篩選8 名牛乳過敏患者（年齡在2～3 歲），4 男4 女，臨床癥狀均為特異性皮炎，收集血清，血清IgE抗體含量為25～100 kU/L。5 名非牛乳過敏兒童（5～10 歲）血清作為陰性對照。陽性、陰性血清均等體積混合用以識別交叉過敏原。

1.3.2 牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體的制備、亞型鑒定及效價測定

牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體的制備按照Docena等[9]的方法，亞型鑒定采用IgG酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測定，間接ELISA法測定單抗效價[10]，以5 μg/mL的αS1-酪蛋白（溶解液為50 mmol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）作為包被抗原，抗體按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000倍數(shù)稀釋（稀釋液為磷酸鹽緩沖溶液），底物顯色液為60 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于10 mL二甲基亞砜配制而成。以未被免疫的正常小鼠血清為陰性對照，測定450 nm波長處的OD值。

1.3.3 牛乳αS1-酪蛋白與大豆蛋白交叉反應(yīng)原的鑒定

分別以牛乳過敏患者血清、αS1-酪蛋白單抗為探針，用免疫印跡法識別大豆蛋白交叉過敏原。首先用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離αS1-酪蛋白、α-酪蛋白、大豆分離蛋白、牛乳蛋白，然后將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)而在膜上完成免疫印跡反應(yīng)，一抗為牛乳過敏患者混合血清（稀釋倍數(shù)1∶10）或αS1-酪蛋白抗體（稀釋倍數(shù)1∶16 000），二抗為HRP-鼠抗人IgE（稀釋倍數(shù)1∶2 000）或HRP-羊抗小鼠IgG（稀釋倍數(shù)1∶4 000），以4-氯-1-萘酚為底物顯色液[11-13]。陰性血清作對照。

1.3.4 牛乳αS1-酪蛋白與大豆Gly m Bd 60K的氨基酸序列比對

通過GenBank檢索αS1-酪蛋白與Gly m Bd 60K的基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件導(dǎo)出各蛋白的氨基酸序列，利用NCBI網(wǎng)頁工具中的BLASTp工具比對相似氨基酸序列[14-17]。

1.3.5 交叉過敏原在模擬胃液中的消化穩(wěn)定性

胃蛋白酶活力的測定采用GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》[18]中的福林-酚法。消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)參照國家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)部869號公告-2-2007《模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性試驗(yàn)方法》[19]進(jìn)行。以國際公認(rèn)的過敏原雞蛋清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑為陽性對照，無致敏性的馬鈴薯酸性磷酸酶為陰性對照。將模擬胃液消化處理的樣品進(jìn)行SDS-PAGE。

1.3.6 加熱對過敏原交叉反應(yīng)特性的影響

以不同加熱時間和加熱溫度對分離提取的大豆蛋白Gly m Bd 60K進(jìn)行加熱處理，分別于70、100 ℃對Gly m Bd 60K加熱10、20、30、40、50、60 min。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)以αS1-酪蛋白單抗為探針評價加熱對過敏原交叉反應(yīng)性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用微軟Excel 2010軟件進(jìn)行圖表制作，采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳過敏患者血清識別交叉過敏原

圖1 牛乳過敏患者血清識別大豆蛋白交叉過敏原Fig. 1 Identification of cross-reactive allergens with cow milk allergic patients' sera

如圖1A所示，第3泳道大豆蛋白條帶由上到下分別為α’亞基、α亞基、β亞基、A3、11S酸性鏈、38 kDa、11S堿性鏈、14.4 kDa蛋白，第4泳道牛乳蛋白條帶由上到下分別為乳鐵蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。圖1B為牛乳過敏患者混合血清識別4 種蛋白的結(jié)果，牛乳過敏患者混合血清與αS1-酪蛋白發(fā)生了特異性反應(yīng)，說明患者血清中含有αS1-酪蛋白特異性IgE。牛乳過敏患者混合血清與大豆中的β-伴大豆球蛋白α亞基（Gly m Bd 60K）和11S堿性鏈發(fā)生了免疫反應(yīng)。為排除假陽性反應(yīng)，用小鼠陰性血清進(jìn)行了免疫印跡實(shí)驗(yàn)，如圖1C所示，陰性小鼠血清與αS1-酪蛋白、α-酪蛋白沒有發(fā)生反應(yīng)，與大豆分離蛋白反應(yīng)了一個條帶，分子質(zhì)量為21 kDa的11S堿性鏈，說明11S堿性鏈為非特異性吸附。即牛乳過敏患者血清識別大豆蛋白的交叉過敏原為β-伴大豆球蛋白α亞基（Gly m Bd 60K）。

2.2 牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體識別交叉過敏原

經(jīng)鑒定αS1-酪蛋白單克隆抗體的亞型為IgG1，效價為1∶320 000。將凝膠上的蛋白條帶成功轉(zhuǎn)印到PVDF膜上后，然后通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)鑒定抗體與大豆蛋白的交叉反應(yīng)特性，結(jié)果見圖2A，αS1-酪蛋白、α-酪蛋白、大豆分離蛋白與αS1-酪蛋白抗體均發(fā)生了免疫反應(yīng)，與大豆分離蛋白反應(yīng)結(jié)果顯示出2 個條帶，測定其分子質(zhì)量分別為68、21 kDa，即為β-伴大豆球蛋白α亞基（Gly m Bd 60K）和11S堿性鏈。為排除假陽性反應(yīng)，用小鼠陰性血清進(jìn)行了免疫印跡抑制實(shí)驗(yàn)，如圖2B所示，小鼠陰性血清與αS1-酪蛋白、α-酪蛋白沒有發(fā)生反應(yīng)，與大豆分離蛋白反應(yīng)了1 個條帶，分子質(zhì)量為21 kDa，即為大豆11S堿性鏈。因此大豆β-伴大豆球蛋白α亞基與αS1-酪蛋白抗體發(fā)生了特異性免疫反應(yīng)，為交叉過敏原。

圖2 αS1-酪蛋白單克隆抗體識別大豆分離蛋白的免疫印跡圖Fig. 2 Immunoblotting of soybean protein isolate identi fi ed by αS1-casein monoclonal antibodies

2.3 牛乳αS1-酪蛋白與大豆Gly m Bd 60K的氨基酸序列比對

αS1-酪蛋白在GenBank的登錄號為AAA30429.1，Gly m Bd 60K的登錄號為BAA23360.2，應(yīng)用DNAStar軟件導(dǎo)出各蛋白的氨基酸序列。用BLASTp工具分析兩種蛋白質(zhì)的序列相似性為39%，兩種蛋白的相似氨基酸序列如表1所示。

表1 αS1-酪蛋白與Gly m Bd 60K的相似氨基酸序列Table 1 Similar amino acid sequences between αS1-casein and Gly m Bd 60K

2.4 交叉過敏原的消化穩(wěn)定性

圖3 過敏原在體外模擬胃液中消化性后的SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE profile of allergens digested in simulated gastric fluid

本實(shí)驗(yàn)以雞蛋清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑為陽性對照，以馬鈴薯酸性磷酸酶為陰性對照，通過比較這5 種蛋白在體外模擬胃消化系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，探究交叉過敏原Gly m Bd 60K（β-伴大豆球蛋白的α亞基）的穩(wěn)定性。如圖3所示，大豆胰蛋白酶抑制劑到60 min仍未被胃蛋白酶消化，推測其具有很強(qiáng)的抗消化性；雞蛋清白蛋白在30 min時條帶完全消化；αS1-酪蛋白在2 min時條帶完全消化；馬鈴薯酸性磷酸酶經(jīng)過胃蛋白酶消化15 s時條帶消失。交叉過敏原Gly m Bd 60K在15 s條帶顏色雖然變淺，但仍清晰可見，2 min時條帶消失，推測Gly m Bd 60K在模擬胃液中的消化時間為2 min。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，消化穩(wěn)定性由強(qiáng)到弱為大豆胰蛋白酶抑制劑＞雞蛋清白蛋白＞αS1-酪蛋白= Gly m Bd 60K＞馬鈴薯酸性磷酸酶，大豆交叉過敏原Gly m Bd 60K的消化穩(wěn)定性比較好。

2.5 加熱對過敏原交叉反應(yīng)性的影響

圖4 70、100 ℃加熱Gly m Bd 60K免疫印跡鑒定圖Fig. 4 Immunoblotting pattern of Gly m Bd 60K heated at 70 or 100 ℃

從圖4可以看出，在70、100 ℃加熱不同時間，Gly m Bd 60K與αS1-酪蛋白單克隆抗體發(fā)生了特異性免疫反應(yīng)，陰性血清結(jié)果有效排除了假陽性反應(yīng)，即加熱沒有影響Gly m Bd 60K與αS1-酪蛋白抗體的交叉反應(yīng)性。

3 討 論

食物交叉過敏一般發(fā)生在同源性比較高或者是具有相似線性表位或構(gòu)象表位的過敏蛋白之間，有研究表明構(gòu)象表位在交叉過敏反應(yīng)中貢獻(xiàn)不大[20]。目前公認(rèn)的預(yù)測交叉過敏反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)為：在超過80 個氨基酸殘基的過敏蛋白質(zhì)中，其序列的同源性大于30%或者具有6 個連續(xù)相似的氨基酸序列，則認(rèn)為有可能產(chǎn)生交叉過敏反應(yīng)[21]，但是預(yù)測的結(jié)果往往會出現(xiàn)假陽性，如果同源性大于35%，假陽性減少4%[22]。因此，過敏原之間序列的同源性的比較只作為一種預(yù)測交叉過敏的方法，體外實(shí)驗(yàn)檢測以及臨床的診斷才是確認(rèn)過敏原是否存在交叉過敏的有效方法。本研究通過生物信息學(xué)工具和軟件預(yù)測αS1-酪蛋白和Gly m Bd 60K蛋白序列相似性為39%，并找到兩組相似氨基酸序列，兩種蛋白可能會發(fā)生交叉過敏反應(yīng)。

牛乳過敏發(fā)生率呈上升趨勢，3 歲以內(nèi)兒童牛乳過敏發(fā)生率超過8%[23]，由于乳蛋白之間的抗原表位存在顯著的同源性，目前已有研究表明，許多其他哺乳動物乳蛋白與牛乳蛋白存在較強(qiáng)的交叉反應(yīng)。例如，在Restani等[24]的研究中，牛乳過敏患者血清的IgE能夠識別水牛和羊的乳品蛋白，交叉過敏原主要是α-酪蛋白和β-乳球蛋白，而且在抗體血清IgE識別中，50%的羊乳與牛乳具有相同的親和力，而抗體血清對駱駝乳或人乳的蛋白質(zhì)沒有免疫反應(yīng)。大約50%的牛乳過敏患者對αS1-酪蛋白過敏[25]。根據(jù)國際免疫聯(lián)合會對過敏原的統(tǒng)一命名，αS1-酪蛋白命名為Bos d 9，分子質(zhì)量為25.2 kDa，為1 條單鏈的磷酸化蛋白質(zhì)，由199 個氨基酸構(gòu)成，脯氨酸含量較高，包括大約70%的無規(guī)則結(jié)構(gòu)和小部分的二級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋和β-折疊，沒有二硫鍵，三級結(jié)構(gòu)比較簡單[26]。對于牛乳過敏癥的治療方法主要是避免飲食中的牛乳蛋白質(zhì)，為此對于牛乳過敏嬰幼兒，基于大豆蛋白的配方粉是最理想的替代品。大豆基嬰幼兒配方粉在全球的使用已有100 a左右，在美國、加拿大、中國等國占有一定的嬰幼兒配方食品市場。然而，一些牛乳過敏嬰幼兒也對大豆蛋白過敏[27]。因此開展牛乳蛋白與大豆蛋白交叉過敏原的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近幾年國內(nèi)外開始探究牛乳與大豆蛋白的交叉過敏原。Curciarello等[28]研究發(fā)現(xiàn)牛乳酪蛋白與大豆蛋白的交叉過敏原為Gly m 5，識別的IgE和IgG作用表位存在于α亞基，并且包括構(gòu)象表位。進(jìn)而，還發(fā)現(xiàn)大豆P34與牛乳酪蛋白也具有序列相似的作用表位[29]。Candreva等[30]用牛乳過敏患者血清識別到大豆交叉過敏原蛋白Gly m Bd 28K，其能夠引起人外周血嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，誘發(fā)免疫小鼠IL-13分泌。Candreva等[31]通過酶解的方法獲得αS1-酪蛋白和Gly m 5的多肽，發(fā)現(xiàn)識別的αS1-酪蛋白的4 個作用表位與Gly m 5的3 個作用表位存在共同的序列區(qū)域。在此基礎(chǔ)上，本研究以中國牛乳過敏嬰幼兒血清為探針，通過免疫印跡方法識別鑒定大豆蛋白的交叉過敏原為β-伴大豆球蛋白α亞基，即Gly m Bd 60K蛋白，體外模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)表明α亞基具有較強(qiáng)的抗消化性，熱處理不會影響牛乳αS1-酪蛋白單克隆抗體與α亞基的免疫反應(yīng)特性。

臨床對過敏患者治療時，要充分考慮食物之間的交叉反應(yīng)性，既要找到可能造成高過敏風(fēng)險的食物，還要避免不必要的食物限制。事實(shí)上，對于一些食物，即使體外檢測呈陽性的交叉敏感性，但真正的交叉反應(yīng)性識別并沒發(fā)生，在研究中對這兩個名詞存在一些混淆，交叉反應(yīng)性是用于定義真正的臨床反應(yīng)[32]。例如，腰果過敏患者對開心果具有交叉敏感性，大多數(shù)花生過敏患者可能對其他豆類會呈陽性反應(yīng)，但可以毫無影響地食用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證食物過敏原具有交叉反應(yīng)特性的最有效手段，這也是未來交叉過敏原研究的重點(diǎn)內(nèi)容。目前，對于導(dǎo)致不同食物間交叉過敏的免疫病理學(xué)的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，由于過敏原之間的交叉過敏受到越來越多的關(guān)注，對交叉過敏反應(yīng)的機(jī)理研究也成為當(dāng)務(wù)之急。