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    蛋白質(zhì)氧化對(duì)高白鮭肌漿蛋白理化特性的影響

    2019-10-08 03:48:36鄧小蓉雷用東盧士玲
    食品科學(xué) 2019年18期
    關(guān)鍵詞:羰基氧化劑巰基

    鄧小蓉,雷用東,2,盧士玲,劉 娟,張 建,*

    (1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆 石河子 832003;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院,農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,新疆 石河子 832000)

    高白鮭(Coregonus peled),屬鮭科,白鮭屬,為冷水性魚類[1],其蛋白質(zhì)含量高,富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等不飽和脂肪酸,易加工。在中國(guó),目前主要以冷凍肉銷售,而在貯藏和分銷過(guò)程中,往往容易發(fā)生由蛋白氧化引起的質(zhì)量劣變[2]。魚肉蛋白對(duì)氧化敏感,研究發(fā)現(xiàn)魚類的肌漿蛋白、肌纖維蛋白和基質(zhì)蛋白,可能會(huì)在肌肉或肉加工過(guò)程中被脂類、金屬離子和其他氧化劑氧化破壞[3-4],而大大降低了其食用品質(zhì)和商品價(jià)值。

    蛋白氧化通過(guò)不同機(jī)理而形成蛋白交聯(lián)派生物,包括二硫化物、二聚酪氨酸和羰基的形成,以及肽鍵斷裂,使蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變[5]。有研究表明氧化使肌纖維蛋白發(fā)生變性,造成蛋白質(zhì)聚合物的形成和蛋白質(zhì)降解,這可能對(duì)蛋白質(zhì)消化率有影響[6-8]。有報(bào)道稱,氧化系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)中的二硫鍵和非二硫鍵可以產(chǎn)生交聯(lián)[9],形成蛋白質(zhì)聚合物,而導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)疏水性基團(tuán)增加,蛋白表面疏水性也隨之增加。蛋白質(zhì)氧化可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象、蛋白溶解性,以及蛋白質(zhì)水解酶的敏感性的改變[10]。Ca和K-ATPase活性受肌漿蛋白上端活性中心的2 個(gè)活性巰基的影響;因此,兩者都可以用作氧化指數(shù),指示肌漿蛋白結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的變性[11]。

    L i Y a n g q i等[12]研究了鯉魚肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins,MP)經(jīng)氧化后,MP的結(jié)構(gòu)和功能變化,顯示MP易受自由基攻擊,氧化應(yīng)激對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和MP的一般功能有不利影響。冷凍也會(huì)誘導(dǎo)魚肉蛋白氧化,而配以冷凍保護(hù)劑可減少鯉魚肉肌纖維蛋白氧化,從而減少有損魚肉質(zhì)構(gòu)變化的蛋白結(jié)構(gòu)改變[13]。目前對(duì)于魚類蛋白質(zhì)的研究主要集中在冷藏或冷凍過(guò)程中蛋白質(zhì)變化和生理變化方面[14-15]。肌漿蛋白占肌肉組織總蛋白的30%,與魚肉的顏色、風(fēng)味、持水性等有關(guān),可間接影響魚肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)[16]。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)以高白鮭肌漿蛋白(sarcoplasmic proteins,SP)為研究對(duì)象,采用羥自由基氧化系統(tǒng)(hydroxyl radical-generating system,HRGS),對(duì)蛋白進(jìn)行不同程度的體外模擬氧化,研究蛋白氧化對(duì)肌肉蛋白物化特性的影響,蛋白氧化及其物化特性指標(biāo)均對(duì)闡釋氧化還原反應(yīng)對(duì)高白鮭肌肉蛋白質(zhì)量的影響具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    高白鮭購(gòu)于新疆賽里木湖,捕撈后立即進(jìn)行內(nèi)臟清理和去鱗處理,封于冰內(nèi)運(yùn)至石河子大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。將魚背部肌肉切割成大小均勻的肉塊(約15 g),置于冰箱(-20 ℃)中備用。

    牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)物 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;其他化學(xué)試劑均為優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Cary 50紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、Cary eclipse熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司。

    1.3 方法

    1.3.1 SP提取

    魚背部肌肉中SP的提取參考Hashimoto[17]和Chine[18]等的方法,提取液分別為磷酸鹽緩沖液A和磷酸鹽緩沖液B,所提取的蛋白用于測(cè)定蛋白氧化后的物化特性變化。

    向魚背部肌肉加入10 倍體積磷酸鹽緩沖液A,均質(zhì)1 min,8 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液,沉淀物再進(jìn)行1 次提取,分別合并2 次提取后的上清液。向上清液中加入10 倍體積的5%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液,8 000 r/min、4 ℃離心15 min,沉淀物即為所需SP。

    1.3.2 蛋白氧化

    HRGS參照Park等[11]的方法進(jìn)行制備,采用H2O2氧化體系,即控制體系中的FeCl3和抗壞血酸(ascorbic acid,Asc)的濃度,改變H2O2濃度(1~20 mmol/L),發(fā)生氧化還原反應(yīng)而生成自由基。將提取的蛋白樣品分別溶解在HRGS的磷酸鹽緩沖溶液(50 mmol/L、pH 6.0)中,然后將樣品在4 ℃條件下分別放置1、3 h和5 h,使肌肉蛋白發(fā)生不同程度的氧化,待蛋白質(zhì)樣品與氧化液反應(yīng)結(jié)束后加入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)以終止氧化反應(yīng)。

    1.3.3 羰基含量的測(cè)定

    參照Oliver等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。取5 mL蛋白樣品于離心管中,每管加入5 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼,室溫下反應(yīng)1 h(每10 min旋渦振蕩1 次)后,添加5 mL 20% TCA溶液,8 000 r/min離心5 min,棄清液;取5 mL體積比為1∶1的無(wú)水乙醇和乙酸乙酯混合溶液清洗沉淀3 次以除去多余的試劑,再向沉淀中加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液后置于水浴鍋中(37 ℃,15 min),將沉淀溶解,8 000 r/min離心5 min除去不溶物質(zhì),離心后的上清液于370 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。采用摩爾消光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)計(jì)算羰基含量。蛋白含量采用Biuret法測(cè)定,用血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.4 總巰基含量的測(cè)定

    參照Simplicio等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。取1 mL蛋白樣品溶液,加入8 mL的Tris-甘氨酸(pH 8,每升該溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol/L尿素),然后均質(zhì),8 000 r/min離心15 min,除去不溶蛋白,再向溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑,反應(yīng)30 min后,于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,采用摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)計(jì)算總巰基含量,采用Biuret法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。除對(duì)照組不加蛋白溶液外,其他處理方法均如上所述。

    1.3.5 游離氨基相對(duì)含量的測(cè)定

    根據(jù)Brands等[21]的方法,采用鄰苯二甲醛(orthophthalaldehyde,OPA)顯色法進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱取40 mg的OPA溶解于1 mL甲醇中,先后加入2.5 mL 20%的十二烷基磺酸鈉、25 mL 0.1 mol/L的硼砂和100 μL β-巰基乙醇,并用蒸餾水定容至50 mL。將200 μL蛋白樣品液分別注入到含有4 mL空白液和4 mL OPA試劑的試管中,混合均勻后在35 ℃條件下反應(yīng)2 min,于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A0和A。游離氨基相對(duì)含量按式(1)計(jì)算:

    1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

    參照Chelh等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定。取1 mL蛋白樣品溶液加入到200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)(bromophenol blue,B P B)中,混勻,室溫下攪拌1 0 m i n,8 000 r/min離心15 min,取上清液于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。將200 μL 1 mg/mL的BPB加入到1 mL 20 mmol/mL的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)作為BPB空白樣,磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)為空白樣,測(cè)定吸光度A0。按式(2)計(jì)算:

    1.3.7 二聚酪氨酸含量的測(cè)定

    參考Davies等[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定二聚酪氨酸含量,測(cè)定條件為發(fā)射波長(zhǎng)420 nm,激發(fā)波長(zhǎng)325 nm,狹縫寬度10 nm。

    1.3.8 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定

    根據(jù)Katoh等[23]的方法測(cè)定。取0.2 mL蛋白樣品溶液于2 mL Ca2+-ATPase反應(yīng)液(內(nèi)含7.6 mmol/L ATP、15 mmol/L CaCl2·2H2O、150 mmol/L KCl、180 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,溫度25 ℃)中反應(yīng)10 min后,加入1.0 mL 10% TCA溶液終止反應(yīng),8 000 r/min離心5 min去除沉淀,取1.0 mL上清液并加入3.0 mL 0.66%的鉬酸銨溶液,充分混合后,加入0.5 mL新配制的10% FeSO4溶液,反應(yīng)2 min,于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷酸鹽的含量。

    1.3.9 SDS-PAGE測(cè)定

    配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的肌肉蛋白溶液置于塑料離心管中,加入等體積的5×樣品緩沖液(含50%甘油、10% SDS、β-巰基乙醇、1% BPB和1 mol/L pH 6.8的Tris-HCl),混勻后,于100 ℃水浴2 min,冷卻至室溫備用。

    十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)參照Laemmli[24]的方法。電泳選用10%的分離膠和5%的濃縮膠,上樣量為5 μL,電泳開始時(shí)將電壓調(diào)到80 V,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)節(jié)到120 V。電泳結(jié)束后,將電泳膠片剝出,用考馬斯亮藍(lán)(2.5 g考馬斯亮藍(lán)R-250,500 mL甲醇,100 mL冰乙酸定容至1 000 mL)染色30 min,然后用脫色液(250 mL甲醇、75 mL冰乙酸,定容至1 000 mL)進(jìn)行多次脫色,直至膠片透明,蛋白質(zhì)樣品分子質(zhì)量的確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的相對(duì)遷移率計(jì)算獲得。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用Origin和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 羰基含量的變化

    圖1 高白鮭SP氧化后羰基含量的變化Fig. 1 Changes in carbonyl content in SP after oxidation

    蛋白質(zhì)氧化過(guò)程復(fù)雜并產(chǎn)生更多的氧化產(chǎn)物,羰基的形成是氧化后蛋白質(zhì)中的一個(gè)最顯著的變化[25-27]。如圖1所示,SP羰基隨氧化劑H2O2濃度和氧化時(shí)間的增加而增加(P<0.05),在經(jīng)過(guò)20 mmol/L H2O2氧化后,羰基含量與未氧化的羰基含量相比增加了41.28%。在較低濃度氧化劑作用下,氧化時(shí)間對(duì)SP羰基含量的變化影響顯著(P<0.05),在較高濃度氧化劑條件下(20 mmol/L)羰基含量變化趨于平衡。肌肉組織中的氨基酸殘基側(cè)鏈和多肽鏈均為自由基攻擊的對(duì)象,氨基酸側(cè)鏈上的—NH—或者是—NH2被羥自由基氧化,轉(zhuǎn)化成羰基基團(tuán)[28]。實(shí)驗(yàn)中羰基含量的增加可能是由于H2O2中的羥自由基的不斷增加,而羥自由基與氨基酸側(cè)鏈或肽鏈不斷發(fā)生氧化反應(yīng)造成羰基含量的增加。

    2.2 總巰基含量的變化

    如圖2所示,隨著H2O2濃度增大和氧化時(shí)間的延長(zhǎng),可觀察到SP總巰基含量顯著減少(P<0.05),氧化劑H2O2(20 mmol/L)氧化5 h后SP總巰基含量減少了65.9%。結(jié)果表明總巰基含量對(duì)氧化劑濃度和作用時(shí)間均敏感。巰基是蛋白質(zhì)中一個(gè)重要的功能基團(tuán),具有很高的抗氧化活性,在H2O2存在的條件下極易氧化,形成各種氧化產(chǎn)物,例如—SOH、—SOOH、—SS—,而導(dǎo)致總巰基的減少[13,29-30]。另外有報(bào)道稱,氧化系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)中的二硫鍵和非二硫鍵可以產(chǎn)生交聯(lián),是形成蛋白質(zhì)聚合的主要途徑[9,31]。巰基變化結(jié)果表明,蛋白氧化使SP巰基基團(tuán)氧化形成各種氧化產(chǎn)物,并形成蛋白聚合物。

    圖2 高白鮭SP氧化后總巰基含量的變化Fig. 2 Changes in total sulfhydryl content in SP after oxidation

    2.3 游離氨基相對(duì)含量變化

    圖3 高白鮭SP氧化后游離氨基相對(duì)含量的變化Fig. 3 Changes in free amino group content of SP after oxidation

    如圖3所示,隨著H2O2濃度增加和氧化時(shí)間延長(zhǎng),游離氨基相對(duì)含量減少(P<0.05)。在H2O2濃度達(dá)到20 mmol/L和氧化時(shí)間達(dá)到5 h時(shí),SP游離氨基相對(duì)含量顯著減少,更長(zhǎng)的氧化時(shí)間或更高的H2O2濃度,蛋白的游離氨基相對(duì)含量趨于減少。結(jié)果表明,游離氨基相對(duì)含量的降低,可能與蛋白氨基酸側(cè)鏈中含有—NH—或—NH2的氨基酸參與了羰基的形成有關(guān),這與羰基結(jié)果變化趨勢(shì)相呼應(yīng)(圖1),結(jié)果與Morzel等[32]對(duì)豬骨胳肌MP氧化后游離氨基的研究結(jié)果相似。理論上,活性氧主要的攻擊對(duì)象是蛋白質(zhì)中的氨基酸側(cè)鏈,所有的氨基酸幾乎都可以被自由基攻擊,但是不同的氨基酸對(duì)自由基的敏感程度不同,蛋白中具體哪種氨基酸側(cè)鏈參與反應(yīng),還需進(jìn)一步研究。

    2.4 表面疏水性的變化

    圖4 高白鮭SP氧化后表面疏水性的變化Fig. 4 Changes in surface hydrophobicity of SP after oxidation

    如圖4所示,經(jīng)氧化劑H2O2處理后,SP表面疏水性均增加,與氧化劑濃度和氧化時(shí)間呈正相關(guān)。與對(duì)照組相比,氧化劑H2O2的加入可顯著增加SP表面疏水性(P<0.05),隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)SP表面疏水性增加(P<0.05),與羰基增加趨勢(shì)相似,結(jié)果與Liu Qian等[13]的研究結(jié)果相似。蛋白疏水性增加,可能與疏水氨基酸殘基暴露密切相關(guān)[27],總巰基變化產(chǎn)生的二硫鍵和非二硫鍵產(chǎn)生交聯(lián),而導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水性基團(tuán)增加[31]。另外,疏水性增加可能還與蛋白質(zhì)聚合物的形成會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水性基團(tuán)增加有關(guān)[27]。

    2.5 二聚酪氨酸含量的變化

    圖5 高白鮭SP氧化后二聚酪氨酸含量的影響Fig. 5 Changes in dityrosine content of SP after oxidation

    二聚酪氨酸的形成是蛋白在自由基氧化體系中發(fā)生氧化的一個(gè)重要標(biāo)記。如圖5所示,隨著H2O2濃度增加和氧化時(shí)間延長(zhǎng),二聚酪氨酸含量明顯增加(P<0.05)。在較低濃度氧化劑作用下,氧化時(shí)間對(duì)SP二聚酪氨酸含量的變化影響顯著(P<0.05),在較高濃度氧化劑條件下(20 mmol/L)二聚酪氨酸含量變化趨于平衡。在H2O2濃度達(dá)到20 mmol/L和氧化時(shí)間達(dá)到5 h時(shí),SP二聚酪氨酸含量與未氧化時(shí)相比增加了39.5%。結(jié)果說(shuō)明蛋白氧化使蛋白氨基酸側(cè)鏈發(fā)生改變,酪氨酸-酪氨酸交聯(lián),形成酪氨酸二聚體。蛋白氧化過(guò)程中,二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)起到主要作用,二聚酪氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用并不顯著[5]。因此,二聚酪氨酸結(jié)果可顯示蛋白氨基酸側(cè)鏈形成交聯(lián),是否交聯(lián)形成蛋白質(zhì)聚合物需進(jìn)一步驗(yàn)證。

    2.6 Ca2+-ATPase活性的變化

    圖6 高白鮭SP氧化后對(duì)Ca2-ATPase活性的影響Fig. 6 Changes in Ca2+-ATPase activity of SP after oxidation

    Ca2+-ATPase活性受SP上端活性中心的活性巰基的影響[33],可用作氧化指數(shù),指示SP結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的變性[34]。同時(shí),在蛋白氧化過(guò)程中,會(huì)造成酶活性發(fā)生改變,Ca2+-ATPase活性是反映蛋白變性程度的重要指標(biāo)之一。SP氧化研究顯示H2O2的添加可降低蛋白Ca2+-ATPase活性。如圖6所示,Ca2+-ATPase活性隨氧化劑濃度增加和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,活性降低明顯(P<0.05),在較高濃度水平(15 mmol/L和20 mmol/L)時(shí)達(dá)到平衡。Wang Baowu等[35]的報(bào)道顯示新鮮牛肉肌原纖維分離的SP Ca2+-ATPase活性與巰基含量密切相關(guān),但在凍結(jié)肌纖維蛋白樣品中,它與疏水氨基酸殘基暴露密切相關(guān)。研究結(jié)果表明,SP Ca2+-ATPase活性的降低,與巰基氧化形成二硫鍵有關(guān)[36],造成酶活性中心發(fā)生改變,而使Ca2+-ATPase活性下降。

    2.7 SDS-PAGE圖譜分析

    如圖7A所示,高白鮭SP氧化后的蛋白質(zhì)條帶發(fā)生了明顯的變化。SP氧化后,14~25 kDa和70~160 kDa的分子條帶變淡,這可能是蛋白氧化使低分子物質(zhì)發(fā)生聚合,而高分子物質(zhì)發(fā)生斷裂,出現(xiàn)新的30~70 kDa之間的中間條帶。延長(zhǎng)氧化時(shí)間,SP的新條帶逐漸減弱(圖7B)。蛋白氧化通過(guò)不同機(jī)理而形成蛋白交聯(lián)派生物,包括二硫化物、二聚酪氨酸和羰基的形成,以及肽鍵斷裂,使蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變[5]。由此可見(jiàn),由于氧化劑的介入,SP發(fā)生聚合,同時(shí)肽鍵斷裂,發(fā)生蛋白降解,從而改變了蛋白的物化特性。

    圖7 高白鮭SP經(jīng)氧化后的SDS-PAGE圖譜Fig. 7 SDS-PAGE patterns of C. peled SP after oxidation

    3 結(jié) 論

    在HRGS系統(tǒng)內(nèi),可明顯地觀察到高白鮭SP氧化反應(yīng)(P<0.05)。結(jié)果表明,氧化劑H2O2(1~20 mmol/L),使高白鮭SP的羰基含量、二聚酪氨酸含量、表面疏水性均明顯增加(P<0.05),低濃度范圍內(nèi)(1、5 mmol/L和10 mmol/L H2O2),對(duì)氧化劑濃度敏感??値€基含量、游離氨基相對(duì)含量和Ca2+-ATPase活性降低(P<0.05),在整個(gè)過(guò)程中呈濃度依賴型,中高濃度范圍內(nèi)(10、15 mmol/L和20 mmol/L H2O2),對(duì)氧化劑濃度敏感。隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)(1、3 h和5 h),SP的物化指標(biāo)變化趨勢(shì)與氧化劑濃度相似,在相同氧化劑濃度下,氧化時(shí)間越長(zhǎng)(5 h),對(duì)氧化時(shí)間越敏感。SDS-PAGE測(cè)定從分子水平上證實(shí)了,蛋白氧化使蛋白聚合和肽鍵斷裂分解。因此,高白鮭貯藏和加工條件尤為重要,防止過(guò)程中因外界因素導(dǎo)致肌肉蛋白氧化,從而減輕蛋白氧化對(duì)高白鮭肌肉蛋白物化特性的改變。

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