釀造啤酒大麥發(fā)芽前后多酚組分變化及抗氧化活性

李葦舟，李福香，何曉琴，李富華,2，趙吉春,2，雷 琳，明 建,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

大麥（Hordeum vulgareL.），屬禾本科（Poaceae）、大麥屬（Hordeum），別名牟麥、赤膊麥、飯麥，為一年生禾本植物。麥芽為大麥的成熟果實經(jīng)發(fā)芽干燥而制備的加工品[1]。

大麥作為我國主要農(nóng)作物之一，在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中有很重要的地位，大麥及麥芽具有助消化、催乳、抗結(jié)腸炎、降血糖血脂等藥理性作用[2-6]，主要用作飼料和啤酒工業(yè)原料[7-8]，僅有小部分為人類直接食用。發(fā)芽使得大麥糊粉層、胚乳中的營養(yǎng)物質(zhì)充分溶解，小分子可溶性糖及含氮化合物含量增加，胚乳結(jié)構(gòu)變得疏松，使其滿足啤酒工藝中制糖流程的需求[9-10]。近年我國啤酒工業(yè)快速發(fā)展，但大麥?zhǔn)袌鲋饾u萎縮，國內(nèi)種植大麥產(chǎn)量已不能滿足啤酒工業(yè)對原料的需求，導(dǎo)致進口大麥數(shù)量猛增[11-12]。大麥及麥芽富含多酚類物質(zhì)，對啤酒的色、香、味及穩(wěn)定性有較大影響[13-15]。然而，對于大麥發(fā)芽前后多酚組分及抗氧化活性比較的報道較少。本實驗選取8 種釀造啤酒大麥及發(fā)芽后的麥芽為原料，旨在通過測定多酚含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力及氧自由基吸收能力，比較大麥發(fā)芽前后多酚含量、組分及抗氧化活性上的差異，研究釀造啤酒大麥發(fā)芽前后的多酚變化，為啤酒原料選取，工藝優(yōu)化，產(chǎn)品貯藏等提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒大麥及麥芽樣品由永順泰（秦皇島）麥芽有限公司提供（原料產(chǎn)地見表1），將干燥的大麥及麥芽機械粉碎，過60 目篩，分袋真空包裝，保存于低溫冰箱（4 ℃）備用。

表1 大麥品種及產(chǎn)地Table 1 Geographical origins and varieties of 8 varieties of barley used in this study

丙酮、乙酸乙酯、氫氧化鈉、正己烷等（均為分析純）成都科龍化工試劑廠；熒光素鈉鹽（FL）、福林-酚試劑、水溶性VE（Trolox）、DPPH（分析純） 美國Sigma公司；2,2’-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（ABAP）（分析純） 日本W(wǎng)ako化學(xué)試劑公司；甲醇、沒食子酸、原兒茶素、葒草素、阿魏酸等（均為色譜純） 成都普瑞法科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HW-7FCS制冰機 日本三洋公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；1-15PK高速離心機 美國Sigma公司；JH722分光光度計 上海精科科學(xué)儀器廠；Spectra Max M2多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚的提取

游離酚的提?。簠⒄誒karter[16]和Adom[17]等的方法，并根據(jù)本實驗室條件稍作修改。準(zhǔn)確稱取2.50 g樣品加入50 mL 80%的丙酮溶液，冰浴中均質(zhì)（2 min，3 次），離心（3 500 r/min，10 min），取上清液，殘渣重復(fù)上述操作2 次，所得全部上清液抽濾后于45 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，純水定容至25 mL，分裝后于-40 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

結(jié)合酚的提?。簠⒄誒karter[16]和Nuutila[18]等的方法，根據(jù)本實驗室條件稍作修改。上述殘渣加入50 mL 2 mol/L NaOH溶液，避光消化1.5 h，調(diào)pH值為2。除脂：加入25 mL正己烷，避光攪拌10 min后離心（3 500 r/min，10 min），去除上清液，重復(fù)以上操作1 次。加入乙酸乙酯25 mL，避光攪拌10 min后離心（3 500 r/min，10 min），取上清液，重復(fù)提取5 次。所得全部上清液抽濾后于45 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，純水定容至10 mL，分裝后于-40 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多酚含量的測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：參照Adom[17]和Chu[19]等方法，取一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液200 μL于試管，依次加入800 μL純水、200 μL福林-酚試劑搖勻，靜置6 min，再加入2 mL 7% Na2CO3溶液和1.6 mL純水搖勻，使其充分混合，避光靜置90 min，于760 nm波長處測其吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=0.003 4x+0.067 7（R2=0.991 7）

大麥及麥芽樣品中多酚類化合物含量的檢測：結(jié)果以每克大麥或麥芽樣品（干質(zhì)量）中所含的沒食子酸當(dāng)量（mg/g）表示。每個樣品做3 組平行，結(jié)果表示為 ±s。

1.3.3 多酚組分鑒定

參照李富華[20]的方法并適當(dāng)修改。

色譜條件：色譜柱：T h e r m o B D S C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A：0.2%甲酸；流動相B：100%乙腈；流速：0.7 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；檢測器：日本島津LC-20A二極管陣列檢測器，色譜數(shù)據(jù)在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，檢測波長280 nm。梯度洗脫程序為：0～5 min，10% B；5～50 min，10%～40% B；50～55 min，40%～90% B；55～62 min，90% B；62～65 min，90%～10% B；65～75 min，10% B。

1.3.4 大麥發(fā)芽前后多酚抗氧化活性的測定

1.3.4.1 多酚DPPH自由基清除活性測定

參考Vaher[21]、Alvarez[22]及Van[23]等的方法。將樣品提取液做相應(yīng)稀釋，配制一定濃度梯度的樣品反應(yīng)液，加入5 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混勻，避光靜置30 min，于517 nm波長處檢測。實驗以VC為對照，純水做空白試驗。每個樣品做3 個平行，以IC50值表示清除DPPH自由基強度。根據(jù)式（1）計算樣品DPPH自由基清除率：

式中：Ai為樣品的吸光度；Aj為空白實驗的吸光度。

1.3.4.2 多酚ORAC值測定

參考Alvarez[22]和Wolfe[24]等的方法。將20 μL磷酸緩沖液（空白液）、6.25 μmol Trolox標(biāo)準(zhǔn)液和1 μg/mL的樣品液，分別點樣到96 孔黑色酶標(biāo)板。于37 ℃溫育10 min后加入200 μL 0.96 μmol/L的熒光工作液振蕩20 min，迅速加入119 mmol/L ABAP工作液20 μL，于激發(fā)波長485 nm、入射波長520 nm條件下立即讀數(shù)，每4.5 min進行讀數(shù)，共2.5 h。根據(jù)測定值計算抗氧化能力指數(shù)（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），按照式（2）計算熒光衰減曲線下的面積（AUC）、按照式（3）計算ORAC值。

式中：f1為第1次熒光讀數(shù)值；fn為第n次熒光讀數(shù)值；CT為間隔測定時間。最終的ORAC值以Trolox當(dāng)量表示（μmol/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 22.0進行單因素ANOVA分析、Duncan多重比較（P＜0.05）分析，多酚組分與抗氧化活性變化采用主成分分析（principal component analysis，PCA），其中變量為8（品種）×7（組分），通過PCA降維所得載荷圖和不同品種樣品得分圖，分析大麥發(fā)芽前后多酚組分變化趨勢。每組實驗至少重復(fù)3 次，結(jié)果表示為 ±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥發(fā)芽前后多酚含量變化

由表2可知，大麥發(fā)芽前后多酚含量變化顯著，所得結(jié)果與朱麗麗[9]、綦文濤[25]等研究相似。除Baudin、Sebastion外，大麥發(fā)芽后游離酚、結(jié)合酚、總酚含量均顯著升高（P＜0.05），較發(fā)芽前提升1.19～2.75、1.02～2.40 倍和1.24～2.21 倍，其中，Hindmarsh與Irima游離酚含量增幅最大（分別為2.75 倍和2.25 倍），Scope與Metcalf結(jié)合酚含量增幅最大（分別為2.40 倍和2.07 倍），Hindmarsh與Irima總酚含量增幅最大（分別為2.21 倍和2.11 倍）。此外，Hindmarsh大麥發(fā)芽后，其游離、結(jié)合及總酚含量均最高（分別為（409.66±13.22）、（196.19±5.89）、（605.86±12.98）mg/100 g）。而Sebastion發(fā)芽后游離、結(jié)合及總酚含量均顯著下降（P＜0.05），Baudin結(jié)合酚與總酚含量顯著下降（P＜0.05），而游離酚含量顯著上升（P＜0.05），這可能是發(fā)芽過程中多酚組分與其他還原性物質(zhì)的平衡發(fā)生改變導(dǎo)致的。

表2 大麥發(fā)芽前后多酚含量Table 2 Free and bound phenolic contents of eight varieties of barley and corresponding malts mg/100 g

2.2 大麥發(fā)芽前后多酚組分鑒定

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig. 1 Chromatograms of polyphenol standard mixture

表3 標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程Table 3 Regression equations for polyphenol standard substances

表4 大麥發(fā)芽前后游離酚組分和含量Table 4 Tpyes and contents of free polyphenols in barley and malt μg/g

表5 大麥發(fā)芽前后結(jié)合酚組分和含量Table 5 Types and contents of bound polyphenols in barley and malt μg/g

多酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及回歸方程如圖1和表3所示。由表4和表5可知，大麥發(fā)芽前后游離酚、結(jié)合酚組分變化顯著。

在游離酚中，大麥發(fā)芽后，沒食子酸和阿魏酸總體顯著高于原始大麥（P＜0.05），增高幅度分別為21%～360%，49%～148%；而原兒茶素、葒草素總體顯著降低，降低幅度分別為5%～71%，7%～100%。其中，發(fā)芽后沒食子酸、阿魏酸含量最高的是Hindmarsh（（72.69±2.00）、（127.89±2.94）μg/g）與Irima（（63.90±0.68）、（124.18±9.88）μg/g）。此外，Metcalf大麥在發(fā)芽后檢測到新物質(zhì)葒草素，而Metcalf大麥中咖啡酸、Scope大麥中葒草素及Sebastion大麥中沒食子酸在發(fā)芽后均未被檢測到。這有可能是大麥發(fā)芽過程中多酚氧化酶、水解酶等作用，致使多酚某些特定組分與木質(zhì)素、阿拉伯木聚糖結(jié)合等變化引起的[26]。

結(jié)合酚中，大麥發(fā)芽后，原兒茶素、香草醛、葒草素和阿魏酸總體顯著高于原始大麥（P＜0.05），增高幅度分別為6%～117%、25%～195%、1%～94%和11%～109%。發(fā)芽后沒食子酸、原兒茶素、咖啡酸與槲皮素含量最高的是Scope（（46.80±9.04）、（21.01±0.50）、（36.27±2.02）、（258.82±2.92）μg/g）。此外，較游離酚而言，結(jié)合酚增加了槲皮素。

綜上，大麥發(fā)芽使得大部分單體酚含量增加，總酚含量呈上升趨勢，這可能與胚乳在發(fā)芽期間某些營養(yǎng)物質(zhì)的釋放和結(jié)合有關(guān)[9]。

2.3 PCA法分析大麥發(fā)芽前后多酚組分變化

圖2 大麥發(fā)芽前后游離酚PCAFig. 2 Principal component analysis of free phenolics in 8 varieties of barley and corresponding malts

由圖2可知，在大麥游離酚中，提取前2 個主成分可以解釋89.37%的總變異，其中第1主成分包含最多的“信息量”，并以香草醛、原兒茶素、阿魏酸、沒食子酸、咖啡酸為主，可以解釋73.52%的總變異。在麥芽游離酚中，提取前2 個主成分可以解釋81.14%的總變異，其中第1主成分以原兒茶素、葒草素、阿魏酸、香草醛、沒食子酸為主，可以解釋56.24%的總變異。此外，這8 個品種大麥及麥芽均無明顯相似性，這可能是所檢測游離酚的品種差異性導(dǎo)致的。

圖3 大麥發(fā)芽前后結(jié)合酚PCAFig. 3 Principal component analysis of bound phenolics in 8 varieties of barley and corresponding malts

由圖3可知，大麥結(jié)合酚中，提取前2 個主成分可以解釋91.00%的總變異，其中第1主成分以沒食子酸、阿魏酸、香草醛、原兒茶素、槲皮素、咖啡酸為主，可以解釋78.20%的總變異。在麥芽結(jié)合酚中，提取前2個主成分可以解釋86.91%的總變異，其中第1主成分以咖啡酸、槲皮素、原兒茶素、阿魏酸為主，可以解釋70.92%的總變異。此外，這8 個品種大麥及麥芽均未表現(xiàn)出明顯相似性，這可能是所檢測結(jié)合酚的品種差異性導(dǎo)致的。

2.4 大麥發(fā)芽前后多酚清除DPPH自由基能力

圖4 大麥發(fā)芽前后游離酚（A）、結(jié)合酚（B）DPPH自由基清除能力（IC50值）Fig. 4 DPPH radical scavenging capacity (IC50) of free (A) and bound (B)phenolic of 8 varieties of barley and corresponding malts

由圖4A可知，大麥發(fā)芽之后游離酚清除DPPH自由基能力顯著改變，其中Hindmarsh、Irima、Esterel、Metcalf、Commander及Baudin的IC50值顯著升高（P＜0.05），表明這6 種大麥發(fā)芽之后游離酚清除DPPH自由基能力顯著下降；Scope、Sebastion的IC50值顯著下降（下降幅度依次為43%、21%）（P＜0.05），表明這兩種大麥發(fā)芽后游離酚清除DPPH自由基能力顯著上升。另外，Scope大麥發(fā)芽之后游離酚清除DPPH自由基能力（IC50值為18.703 μg/mL）顯著高于其他品種（P＜0.05）。由圖4B可知，大麥發(fā)芽之后結(jié)合酚清除DPPH自由基能力顯著改變，Hindmarsh、Esterel、Metcalf及Commander的IC50值顯著下降（下降幅度依次為11%、46%、7%、6%）（P＜0.05），表明這5 種大麥發(fā)芽后結(jié)合酚清除DPPH自由基能力顯著上升。另外，Esterel大麥發(fā)芽之后結(jié)合酚清除DPPH自由基能力（IC50值為54.252 μg/mL）顯著高于其他品種（P＜0.05）。

綜上，大麥發(fā)芽后游離、結(jié)合酚清除DPPH自由基能力變化各有差異，但結(jié)合酚清除DPPH自由基能力普遍增強，其中，Scope大麥發(fā)芽之后游離酚清除DPPH自由基能力達到最高，Esterel大麥發(fā)芽之后結(jié)合酚清除DPPH自由基能力達到最強。

2.5 大麥發(fā)芽前后多酚的ORAC值

圖5 大麥發(fā)芽前后游離酚（A）、結(jié)合酚（B）的ORAC值Fig. 5 Oxygen radical absorbance capacity of free (A) and bound (B)phenolics in 8 varieties of barley and corresponding malts

由圖5A可知，大麥發(fā)芽之后游離酚的氧自由基吸收能力顯著改變，其中Irima、Commander及Sebastion的ORAC值顯著升高（上升幅度依次為130%、173%、167%）（P＜0.05），表明這3 種大麥發(fā)芽之后游離酚氧自由基吸收能力顯著提升；Hindmarsh、Sebastion的ORAC值顯著下降（P＜0.05），表明這兩種大麥發(fā)芽之后游離酚氧自由基吸收能力顯著下降。由圖5B可知，大麥發(fā)芽之后結(jié)合酚的氧自由基吸收能力顯著改變，其中Esterel與Baudin的ORAC值顯著升高（上升幅度依次為129%、132%）（P＜0.05），表明這兩種大麥發(fā)芽之后結(jié)合酚氧自由基吸收能力顯著提升；Hindmarsh與Sebastion的ORAC值顯著下降（P＜0.05），表明這兩種大麥發(fā)芽之后結(jié)合酚氧自由基吸收能力顯著下降。

綜上，大麥發(fā)芽后游離、結(jié)合酚氧自由基吸收能力變化各有差異，但總體呈上升趨勢，且結(jié)合酚氧自由基吸收能力普遍高于游離酚，其中，Commander大麥發(fā)芽之后游離酚氧自由基吸收能力達到最高，Baudin大麥發(fā)芽之后結(jié)合酚氧自由基吸收能力達到最強。

3 結(jié) 論

作為天然抗氧化劑的植物多酚是近幾年的研究熱點，谷物類多酚物質(zhì)的研究逐漸廣泛。大麥及麥芽作為啤酒工藝的主要原料，其品種屬性對啤酒品質(zhì)影響較大，多酚是大麥及麥芽中重要的抗氧化活性成分，對啤酒的穩(wěn)定性有著較大的影響[27-30]。本實驗以8 個品種釀造啤酒大麥及麥芽為原料，比較分析了大麥發(fā)芽前后多酚含量、組成及抗氧化活性的變化。

結(jié)果表明，8 種大麥總酚含量范圍為（179.00±3.14）～（307.88±3.60）mg/100 g，麥芽總酚含量范圍為（187.13±2.81）～（605±7.67）mg/100 g，游離態(tài)多酚是大麥及麥芽多酚的主要存在形式（占53%～95%），發(fā)芽后的麥芽成品總酚含量顯著增加（P＜0.05）。大麥及麥芽游離酚主要有阿魏酸、葒草素、沒食子酸、香草醛、原兒茶素5 種單體酚；而結(jié)合酚有阿魏酸、葒草素、沒食子酸、香草醛、原兒茶素、咖啡酸和槲皮素7 種單體酚。8 個品種大麥及麥芽均具有一定的抗氧化活性，清除DPPH自由基能力的IC50值范圍為（23.70±0.34）～（101.36±1.18）μg/mL，ORAC值范圍為（32.69±0.13）～（166.722±6.48）μmol/g，其中品種Scope麥芽游離酚清除DPPH自由基能力最強，品種Baudin麥芽結(jié)合酚的氧自由基吸收能力最好。發(fā)芽使沒食子酸、阿魏酸含量顯著上升，使游離、結(jié)合酚氧自由基吸收能力總體增強，結(jié)合酚清除DPPH自由基能力普遍提升，麥芽的總體抗氧化活性優(yōu)于大麥。

大麥及麥芽富含多酚且具有較強的抗氧化活性，是植源性多酚的優(yōu)良來源之一。在大麥發(fā)芽過程中多酚含量呈上升趨勢，且單體酚含量的變化對多酚的抗氧化性具有較大的影響。進一步研究大麥多酚組分對抗氧化活性的影響，對啤酒工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。