雙孢蘑菇發(fā)酵液氨基氮含量測定方法的研究

曾志恒 曾 輝 程 翊 施肖堃 謝神斌 戴建清

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所∕特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州350014）

眾所周知，氮源對(duì)食用菌的生長發(fā)育具有重要作用，主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代謝產(chǎn)物[1]。在液體深層發(fā)酵過程中，食用菌菌絲體的生長與氮源代謝有密切關(guān)系。液體培養(yǎng)基配方中的氮源通常采用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆餅粉、麩皮和玉米漿等[2-4]。氨基酸是發(fā)酵液中氮源存在主要形式之一，氨基氮是發(fā)酵液氨基酸中所含氮的總量，因此可以通過測定發(fā)酵液中氨基氮含量變化，掌握氨基氮的變化規(guī)律，了解菌絲體對(duì)氨基氮的利用情況[5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氨基氮含量的測定多采用甲醛滴定法[6-7]，但甲醛滴定法測定氨基氮最低檢測濃度約為0.4 mg∕mL，因此甲醛滴定法用于測定氨基氮含量高的樣品[8]。茚三酮比色法測定氨基氮含量具有靈敏度、準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)被廣泛采用[9-10]，但未見其在食用菌發(fā)酵液中氨基氮含量測定的應(yīng)用。筆者建立了茚三酮比色法測定雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)液氨基氮含量，以期獲得可靠的數(shù)據(jù)，通過掌握液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中以氨基氮形式存在的氮源代謝規(guī)律，為雙孢蘑菇液體菌種的生產(chǎn)實(shí)踐提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株:雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）W192，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所育種室提供。

液體培養(yǎng)基配方:葡萄糖5.00 g∕L，小米粉7.50 g∕L，蛋白胨 2.00 g∕L，黃豆粉 5.00 g∕L，MgSO4·7H2O 0.75 g∕L，KH2PO42.00 g∕L。

主要儀器:UV-1300紫外分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司；TGL-16MS冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋，常州凱航儀器有限公司。

試劑:茚三酮、甘氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，均為分析純。

1%茚三酮顯色劑配制:精確稱取1.0 g茚三酮，少量去離子水溶解，100 mL容量瓶定容，搖勻，避光低溫保存。

磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制:分別將磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀配制成0.1 mol∕L溶液，將不同體積的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀溶液混合，配制成 pH 為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液供試樣品

雙孢蘑菇W192菌種活化、搖瓶培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)[2]。發(fā)酵液用冷凍高速離心機(jī)10 950×g，離心10 min，收集上清液，即得發(fā)酵液供試樣品，4℃保藏、備用。

1.2.2 測定波長的選擇

精密吸取0.3 mL發(fā)酵液供試樣品于25 mL容量瓶中，補(bǔ)水至0.5 mL，再加入2.0 mLpH為6.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和1.5 mL茚三酮顯色劑，混合均勻后，沸水浴中加熱30 min后迅速冷卻至室溫，定容至25 mL后，在500～600 nm，每間隔10 nm波長處，紫外分光光度計(jì)測定吸光度，重復(fù)3次，吸光度值取平均值。

1.2.3 緩沖液pH的選擇

精密吸取0.3 mL發(fā)酵液供試樣品于25 mL容量瓶中，補(bǔ)水至0.5 mL，再加入2.0 mL pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和1.5 mL茚三酮顯色劑，混合均勻后，沸水浴中加熱30 min后迅速冷卻至室溫，定容至25 mL后，在570 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次，吸光度值取平均值。

1.2.4 顯示劑用量

精密吸取0.3 mL發(fā)酵液供試樣品于25 mL容量瓶中，補(bǔ)水至0.5 mL，加入2.0 mL pH為6.5的緩沖液，分別加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL茚三酮顯色劑，混合均勻后，沸水浴中加熱30 min后迅速冷卻至室溫，定容至25 mL后，在570 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次，吸光度值取平均值。

1.2.5 加熱時(shí)間

才三四個(gè)月時(shí)間，小小的墳塋上已經(jīng)長滿雜草，枯黃在寒風(fēng)里；張翔重新將墳挖開，將他母親的骨灰盒并排放在他父親的骨灰盒邊上，但他突然又改變了主意，將母親的骨灰盒壓在父親的骨灰盒上。誰叫母親活著時(shí)受夠了父親的氣。但人活著的時(shí)間總是有限的，而死后的時(shí)間才是無限的，他要母親永遠(yuǎn)壓住父親，讓他永世不得翻身。埋好后，張翔站在墳前抽煙，他為自己的做法得意地大笑，一陣狂笑過后，卻早已淚流滿面。

精密吸取0.3 mL發(fā)酵液供試樣品于25 mL容量瓶中，補(bǔ)水至0.5 mL，再加入2.0 mL pH為6.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和1.5 mL茚三酮顯色劑，混合均勻后，沸水浴中分別加熱10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min后，迅速冷卻至室溫，定容至25 mL，在570 nm波長下測定吸光度。重復(fù)3次，吸光度值取平均值。

1.2.6 氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取甘氨酸置于干燥箱，105℃干燥2 h至恒重，放入干燥器中冷卻至室溫，精確稱取1.25 g甘氨酸，去離子水溶解后100 mL容量瓶定容，配制成12.50 mg∕mL母液，精密吸取1.0 mL甘氨酸母液，25 mL容量瓶定容，配制成0.5 mg∕mL的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.45 mL、0.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，補(bǔ)水至0.5 mL，加入2.0 mL pH為6.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和1.5 mL茚三酮顯色劑，混合均勻后，沸水浴加熱30 min，迅速流水冷卻，定容至25 mL，在570 nm波長下測定吸光度值。以去離子水為空白調(diào)零，以甘氨酸質(zhì)量換算成氨基氮質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 樣品測定

精密移取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液供試樣品0.3 mL于25 mL容量瓶中，補(bǔ)水至0.5 mL，再加入2.0 mL pH為6.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液和1.5 mL茚三酮顯色劑，混合均勻后，沸水浴中加熱30 min，迅速流水冷卻，定容至25 mL，以去離子水為空白，于570 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中氨基氮的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的確定

為了確定茚三酮比色法測定發(fā)酵液中氨基氮的最佳波長，顯色液在波長為500～600 nm進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，顯色液在波長570 nm下，吸光度值最大。因此，確定570 nm作為檢測波長。

圖1 不同波長的吸光度

2.2 緩沖液pH的確定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，茚三酮比色法測定氨基酸受pH影響很大[11]，為了提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，反應(yīng)體系在不同pH條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色液在波長570 nm下，測定吸光度值，結(jié)果見圖2。從圖2中可知，pH在5.0～6.5，隨pH的增大，顯色液吸光度值逐漸增大；當(dāng)pH為6.5時(shí)，顯色液吸光度值達(dá)到最大值；pH在6.5～8.0，隨pH的增大，顯色液吸光度值逐漸減小。由此可見發(fā)酵液中氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)適宜在弱酸的環(huán)境中，故確定反應(yīng)體系加入的緩沖溶液的pH為6.5。

圖2 pH對(duì)吸光度的影響

2.3 茚三酮顯色劑用量的確定

從圖3中可以看出，茚三酮顯色劑用量在0.5～1.5 mL，隨顯色劑用量的不斷增加，顯色液吸光度值逐漸增大；在顯色劑用量為1.5 mL時(shí)，顯色液吸光度值達(dá)到最大值；繼續(xù)增加顯色劑用量，顯色液的吸光度值緩慢降低。因此，確定質(zhì)量濃度為1%的茚三酮顯色劑用量為1.5 mL。

圖3 茚三酮顯色劑用量對(duì)吸光度的影響

2.4 加熱時(shí)間的確定

圖4 顯示了不同沸水浴加熱時(shí)間對(duì)吸光度的影響。由圖4可見，加熱時(shí)間在10～30 min，隨加熱時(shí)間延長，吸光度值緩慢增加；當(dāng)加熱時(shí)間為30 min，吸光值達(dá)到最大值；繼續(xù)延長加熱時(shí)間，吸光值減小，說明30 min為最適加熱時(shí)間。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述建立的檢測條件基礎(chǔ)上，以甘氨酸氨基氮含量為橫坐標(biāo)，吸光度值（OD570）為縱坐標(biāo)，制作出氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，在測定范圍內(nèi)的氨基氮含量與相應(yīng)的吸光度值之間呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為:y=48.803x-0.7603，R2=0.999。

圖5 氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精確度試驗(yàn)

取0.3 mL培養(yǎng)10 d的雙孢蘑菇發(fā)酵液，按照上述建立的檢測條件，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，其吸光度值如表1所示。從表1可以看出，連續(xù)6次的測定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.434%，說明分光光度計(jì)精確度良好。

表1 精確度試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取0.3 mL培養(yǎng)10 d雙孢蘑菇發(fā)酵液，按照上述建立的檢測條件，顯色反應(yīng)完成后每隔10 min測定1次，結(jié)果見表2。由表2可知，顯色液在0～1 h內(nèi)吸光度值波動(dòng)較小，具有較小的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD=0.648%，說明發(fā)酵液經(jīng)茚三酮顯色反應(yīng)后在1 h內(nèi)較穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6.3 加樣回收率

分別于3個(gè)三角瓶中取培養(yǎng)12 d雙孢蘑菇發(fā)酵液0.3 mL，精確加入甘氨酸對(duì)照品適量，按上述建立的檢測方法測定各樣品溶液加樣前后氨基氮吸光度值，根據(jù)氨基氮標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算氨基氮含量、回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表3?；厥章剩≒）公式為:

式中:n1表示實(shí)測量；n2表示樣品量；n3表示加樣量。

表3 樣品加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，樣品溶液氨基氮的平均加樣回收率為100.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.55%。這表明該方法中氨基氮的回收性良好。

3 小結(jié)與討論

通過測定食用菌發(fā)酵液中氨基氮含量變化，可以掌握液體發(fā)酵培養(yǎng)過程中以氨基氮形式存在的氮源代謝規(guī)律。目前，測定食用菌發(fā)酵液中氨基氮含量主要采用甲醛滴定法[6-7]，但甲醛滴定法適合測定氨基氮含量高的樣品[8]，并且測量時(shí)使用的甲醛對(duì)檢測人員和環(huán)境危害較大；測定氨基氮含量還可以采用雙指示劑甲醛滴定法，但滴定終點(diǎn)靠肉眼對(duì)顏色的觀察來判斷，誤差較大[12]。筆者首次建立茚三酮比色法測定雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)液氨基氮含量。該方法具有操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以準(zhǔn)確地測定雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)酵液的氨基氮含量，為液體菌種的生產(chǎn)實(shí)踐提供數(shù)據(jù)支持。