紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物與抗氧化活性研究

范昊安，薛淑龍，王高堅(jiān)，陳小偉，方 晟，沙如意，毛建衛(wèi)*

（1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023；3.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；4.紹興文理學(xué)院 元培學(xué)院，浙江 紹興 312000；5.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興 312000）

食用植物酵素[1]是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類等食材為原料，加（或不加）糖類物質(zhì)，經(jīng)多種有益菌通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物、植物本身營(yíng)養(yǎng)成分和益生菌等功能性成分，特別是富含小分子功能成分，研究表明該類產(chǎn)品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[2-4]。由于酵素的發(fā)酵過(guò)程屬于復(fù)雜的間歇性過(guò)程，其發(fā)酵周期的控制需要結(jié)合期間多種微生物的基質(zhì)代謝與產(chǎn)物生成情況綜合考慮[5-6]。研究發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物及其活性的變化規(guī)律，不僅有利于酵素產(chǎn)品的質(zhì)量控制，還可為其發(fā)酵終點(diǎn)的確定提供理論支撐。

紫蘇葉為唇形科植物紫蘇（Perilla frutescens L.Britt.）的干燥葉（或帶嫩枝）。具有解表散寒、行氣和胃之功效，用于風(fēng)寒感冒，咳嗽嘔惡，妊娠嘔吐，魚蟹中毒[7]。紫蘇葉中富含多種營(yíng)養(yǎng)成分以及多酚、黃酮等多種生物活性物質(zhì)[8]，具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗過(guò)敏、保肝、降血脂、調(diào)節(jié)血糖等藥理作用[9-12]。目前，以紫蘇葉為原料加工制成的保健食品較少，僅有紫蘇茶[13]與紫蘇果酒[14]等。通過(guò)微生物發(fā)酵制備紫蘇葉酵素，可以在保留紫蘇葉本身藥用活性成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增強(qiáng)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及保健功效，對(duì)豐富紫蘇葉的加工形式，實(shí)現(xiàn)其高值化利用具有重大意義。

目前尚未有關(guān)于紫蘇葉酵素的相關(guān)研究報(bào)道，故本試驗(yàn)以紫蘇葉為原料，探究紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸、總糖、總酚、乙醇等代謝產(chǎn)物的變化以及1,1-二苯基-2-苦苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基清除率等抗氧化活性的變化，以期為紫蘇葉綜合開(kāi)發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紫蘇葉：采自浙江省農(nóng)副產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物園；酵液、糖漿：由浙江省農(nóng)副產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

DPPH：梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；福林酚、蒽酮、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris）、水楊酸鈉、FeSO4、H2O2（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。L-乳酸（純度≥98%）、醋酸（純度≥99.9%）、無(wú)水乙醇（優(yōu)級(jí)純）、叔丁醇（純度≥99.5%）：上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

20 L不銹鋼（型號(hào)：316L）發(fā)酵罐：浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；PTX-FA210型電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；Allegra X-12R離心機(jī)：貝克曼庫(kù)爾特有限公司；PHS-3C型精密酸度計(jì)：杭州齊威儀器有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度計(jì)：上海市元析儀器有限公司；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜（配備Waters 2998二極管陣列紫外檢測(cè)器）：美國(guó)沃特世公司；GC-2010氣相色譜：日本島津公司；HSS86.50型頂空進(jìn)樣器：意大利DANI公司；SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)美谷分子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇葉酵素的制備

用無(wú)菌水沖洗新鮮摘取的紫蘇葉，置于陰暗處晾干，粗粉碎，將紫蘇葉和糖漿按質(zhì)量比3∶4加入高壓蒸汽滅菌過(guò)的20 L不銹鋼發(fā)酵罐中，加入10%體積分?jǐn)?shù)的酵液（菌體濃度：1×105CFU/mL）。于室溫（20±5）℃條件下發(fā)酵，定期取樣，將樣品于6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液保存于-80℃超低溫冰箱中，待測(cè)。

1.3.2 總酚含量測(cè)定

采用福林酚法[15]測(cè)定紫蘇葉酵素中總酚含量。取5 μL酵素離心液，加純水至0.5mL，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的福林酚溶液2.5mL，常溫避光靜置反應(yīng)3min后加入75g/LNa2CO3溶液2 mL，混勻。于25℃反應(yīng)1 h，以0.5 mL水按上述方法進(jìn)行空白調(diào)零，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3.3 pH值測(cè)定

參照GB 10468—1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測(cè)定方法》[16]，使用精密pH計(jì)直接測(cè)定酵素樣品pH值。

1.3.4 可滴定酸含量測(cè)定

可滴定酸含量的測(cè)定方法參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定方法》[17]，并加以調(diào)整：取酵素樣品1 mL，用去離子水定容至50 mL，取10 mL稀釋液于錐形瓶中，以0.1g/L酚酞試劑為指示劑，記錄消耗0.002mol/L的氫氧化鈉溶液滴定體積，測(cè)定結(jié)果以蘋果酸質(zhì)量濃度（g/100mL）計(jì)。

1.3.5 有機(jī)酸含量測(cè)定[18]

樣品配制：取離心后的紫蘇葉酵素上清液200 μL，使用0.01 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 2.7）稀釋5倍，經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

標(biāo)品配制：配制乳酸和醋酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

檢測(cè)條件：色譜柱為AgilentTCC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶磷酸二氫鉀緩沖液（pH 2.7）=2∶98；流速1.0mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣體積10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器。

1.3.6 總糖含量測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法[19]測(cè)定紫蘇葉酵素中總糖含量。將樣品液用純水稀釋5 000倍，取稀釋液200 μL，置于冰浴中，加入800 μL 2 mg/mL的蒽酮-硫酸溶液，混合均勻后置于沸水浴中反應(yīng)10 min，冰浴中冷卻至室溫后，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定其吸光度值。并配制質(zhì)量濃度梯度為20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、120 μg/mL、160 μg/mL的葡萄糖溶液，按照上述步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 乙醇含量測(cè)定[20]

樣品配制：取離心后紫蘇葉酵素上清液990 μL，加入10 μL叔丁醇作為內(nèi)標(biāo)，待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配制體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、5.0%的乙醇溶液，上述溶液中均含有體積分?jǐn)?shù)1%的叔丁醇作為內(nèi)標(biāo)，待測(cè)。

自動(dòng)頂空條件：爐溫85℃，平衡時(shí)間40 min；進(jìn)樣閥溫度105℃；傳輸線溫度110℃。

氣相色譜條件：RTX-5毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；柱溫40℃，平衡時(shí)間3.0 min，10℃/min升溫至180℃，保溫5 min；進(jìn)樣口/氣化室溫度200 ℃；分流比30∶1；檢測(cè)器溫度250℃。

1.3.8 DPPH自由基清除能力測(cè)定[21]

取5 μL離心后紫蘇葉酵素上清液，加水稀釋至2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液4 mL，再加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）450 μL，25℃恒溫水浴反應(yīng)30 min，以純水為參比溶液，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值。

式中：A0為空白對(duì)照吸光度值；A1為樣品吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.9 羥自由基清除能力測(cè)定[22]

取250μL離心后紫蘇葉酵素上清液，加水稀釋至2mL，加入6mmol/LH2O2溶液1.4mL，再加入20mmol/L水楊酸鈉0.6 mL和1.5 mmol/L FeSO42 mL，混勻，37℃恒溫水浴反應(yīng)1 h。以純水為參比溶液，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值。

式中：A0為空白對(duì)照吸光度值；A1為樣品吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.10 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)分析

通過(guò)主成分分析法進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，以各主成分所對(duì)應(yīng)的特征值除以所提取主成分的特征值之和，再線性加權(quán)求和得到綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)（composite evaluation index，CEI）。

式中：λ1為主成分1的特征值；λ2為主成分2的特征值；F1為主成分1的因子得分；F2為主成分2的因子得分。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化

紫蘇葉中的酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[23]，紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量變化如圖1所示。

圖1 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenolic content during the Perilla leaves jiaosu fermentation

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚含量呈現(xiàn)先波動(dòng)上升后下降的趨勢(shì)，于發(fā)酵63d時(shí)達(dá)到最大值3.96mg/mL。研究表明，蘋果酵素、葡萄酵素的總酚含量分別為259.4mg/L、2.31 mg/mL[3，6]，本實(shí)驗(yàn)紫蘇葉酵素總酚含量較高，可能是由于物料本身及其自身菌種的差異導(dǎo)致的。GAO K等[24]研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵可將類黃酮物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酚酸產(chǎn)物，致使總酚含量上升。過(guò)量的多酚類物質(zhì)會(huì)抑制益生菌的生長(zhǎng)，同時(shí)體系自身的微生物也會(huì)影響多酚類物質(zhì)的生物功能，故而紫蘇葉酵素中的優(yōu)勢(shì)菌種可能降解部分酚類物質(zhì)，從而維持酚類物質(zhì)含量平衡，導(dǎo)致酵素中總酚含量下降[25]。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中pH值與可滴定酸含量的變化

pH值是酵素發(fā)酵程度的一個(gè)代表性的重要指標(biāo)，總酸是反映酵素發(fā)酵過(guò)程狀況的理化指標(biāo)，同時(shí)也在一定程度上反映了微生物代謝情況。紫蘇葉酵素在發(fā)酵過(guò)程中pH值和可滴定酸的變化如圖2所示。

圖2 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中pH值與可滴定酸含量的變化Fig.2 Changes of pH value,total titratable acidity during the Perilla leaves jiaosu fermentation

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵pH值由4.67持續(xù)下降至3.91?？傻味ㄋ峥傮w呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。前49 d上升速率較快，后期趨于平緩，最終達(dá)到0.918 g/100 mL（以蘋果酸計(jì)）。發(fā)酵過(guò)程中紫蘇葉中的有機(jī)酸的溶出及醋酸菌等大量微生物代謝使得乙醇轉(zhuǎn)化為乳酸、醋酸等有機(jī)酸[26]，導(dǎo)致酵素中可滴定酸含量的快速上升。為更好地解釋發(fā)酵過(guò)程中pH值與可滴定酸含量的變化趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳酸、醋酸的含量變化進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中乳酸、醋酸含量的變化

酵素中存在的最常見(jiàn)的3種菌種為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[1]。其代謝產(chǎn)物乳酸、醋酸等有機(jī)酸的含量變化為酵素品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[27]。乳酸、醋酸標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1。由表1可知，乳酸、醋酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程具有良好線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999 9。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table1 Standard curves of organic acids

紫蘇葉酵素在發(fā)酵過(guò)程中乳酸、醋酸含量變化如圖3所示。由圖3可知，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸、醋酸含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別于發(fā)酵49 d、105 d到達(dá)最大值（4.82 mg/mL、0.90 mg/mL）。發(fā)酵前28 d，醋酸菌等微生物利用葡萄糖、果糖代謝生成醋酸等物質(zhì)，使得乳酸、醋酸含量快速增加[28]；91 d后乳酸、醋酸含量緩慢下降可能是因?yàn)榻湍妇染N在發(fā)酵后期會(huì)降解部分有機(jī)酸，導(dǎo)致乳酸、醋酸含量有所下降[29]。結(jié)合圖2，醋酸、乳酸含量在前28 d的上升導(dǎo)致了可滴定酸的同期上升以及pH值的快速下降。

圖3 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中乳酸、醋酸含量的變化Fig.3 Changes of lactic acid,acetic acid production during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.4 發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化

糖作為酵素發(fā)酵過(guò)程中微生物利用的主要碳源，其含量變化是研究紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝的核心指標(biāo)之一。紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中，總糖含量隨發(fā)酵時(shí)間變化結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中總糖含量先快速下降，而后逐漸升高直至平緩，且在發(fā)酵21 d時(shí)達(dá)到最低值636.33 mg/mL。前期的變化趨勢(shì)可能是由于發(fā)酵過(guò)程中總糖被水解成葡萄糖和果糖并被乳酸菌等微生物利用消耗[30]，結(jié)合圖3可知，前期消耗的總糖有可能被轉(zhuǎn)化為乳酸，導(dǎo)致總糖含量下降以及乳酸含量的上升。發(fā)酵21d后，總糖含量的波動(dòng)可能是由于發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌等菌種逐漸利用糖類物質(zhì)導(dǎo)致的。

圖4 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化Fig.4 Changes of total sugar concentration during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.5 發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的變化

乙醇是一種典型的初級(jí)代謝產(chǎn)物，其含量變化與酵母菌緊密相關(guān)，故而將其作為研究紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝的核心指標(biāo)之一[31]。紫蘇葉酵素在發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的變化如圖5所示。由圖5可知，紫蘇葉酵素在發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的變化呈先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)，并于發(fā)酵105 d達(dá)到最高值1.66%vol。D'AMORE T等[32]研究表明，高糖滲透壓條件會(huì)導(dǎo)致酵母菌細(xì)胞內(nèi)乙醇濃度的增加，從而抑制其生長(zhǎng)和發(fā)酵速率，導(dǎo)致紫蘇葉酵素前21天乙醇含量增長(zhǎng)速率緩慢。發(fā)酵21天總糖含量降至最低，酵母菌發(fā)酵進(jìn)入旺盛期，酵母菌代謝生成乙醇含量速率與前期降糖速率具有一致性。發(fā)酵28 d后乙醇含量的增長(zhǎng)速率減緩可能是由于部分乙醇被醋酸菌利用轉(zhuǎn)化為乙酸，但由于乙醇生成速率仍大于其消耗速率，故乙醇含量仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。發(fā)酵105 d后乙醇含量降低可能是因?yàn)獒劸平湍概c非釀酒酵母混合發(fā)酵引起了較好的降醇效果[33-34]。通過(guò)對(duì)乳酸、醋酸和乙醇含量變化的研究，可據(jù)此推斷紫蘇葉酵素中乳酸菌、酵母菌等微生物的生長(zhǎng)、代謝情況，但具體微生物種類與菌落總數(shù)的變化有待進(jìn)一步研究。

圖5 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的變化Fig.5 Changes of ethanol content during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.6 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基消除率的變化

圖6 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.6 Changes of DPPH free radical scavenging ability during the Perilla leaves jiaosu fermentation

不同發(fā)酵時(shí)間的紫蘇葉酵素DPPH自由基消除率變化如圖6所示。由圖6可知，發(fā)酵前63 d紫蘇葉酵素DPPH自由基消除率呈緩慢上升的趨勢(shì)，清除率達(dá)到最大值61.03%，隨后緩慢下降。郭曉青等[35]報(bào)道紫蘇葉提取物的DPPH自由基清除率明顯低于同濃度維生素C（vitamin C，VC），分析比較可得同等稀釋倍數(shù)下紫蘇葉酵素DPPH自由基清除能力遠(yuǎn)大于紫蘇葉提取物，說(shuō)明適當(dāng)發(fā)酵可提高紫蘇葉的DPPH自由基清除能力。韋仕靜等[36]通過(guò)酵母菌、乳酸菌和醋酸桿菌復(fù)合發(fā)酵西蘭花酵素，并研究發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)其DPPH自由基清除率快速上升后緩慢下降，這與紫蘇葉酵素趨勢(shì)相近。

2.7 發(fā)酵過(guò)程中羥基自由基消除率的變化

羥基自由基是一種較活潑的自由基，同時(shí)也是一種毒性最強(qiáng)的活性氧自由基[37]。會(huì)引起間充質(zhì)干細(xì)胞以及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的氧化損傷，故其清除率是體現(xiàn)酵素抗氧化能力的重要指標(biāo)之一[38]。不同發(fā)酵時(shí)間的紫蘇葉酵素羥基自由基消除率變化如圖7所示。由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，紫蘇葉酵素的羥基自由基清除率逐漸上升，于第91天達(dá)到最大值83.49%，相較發(fā)酵7 d的清除率增長(zhǎng)了92.64%。發(fā)酵91 d后清除率變化趨于穩(wěn)定?？梢?jiàn)適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間同樣有利于提升紫蘇葉酵素羥基自由基的消除能力。肖翔等[39]研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉提取物可提高發(fā)酵液的抗氧化活性，紫蘇葉自身活性成分可與微生物代謝產(chǎn)物相互作用，使得紫蘇葉酵素羥基自由基清除率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。GU L等[40]通過(guò)薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）自顯影等技術(shù)鑒定得出紫蘇中的迷迭香酸與木犀草素等多酚類物質(zhì)發(fā)揮了主要的清除羥基自由基作用。

圖7 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中羥自由基清除能力的變化Fig.7 Changes of hydroxyl free radical scavenging ability during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.8 相關(guān)性分析

紫蘇葉酵素的總酚、pH值、可滴定酸、乳酸、醋酸、乙醇、總糖、DPPH自由基消除率、羥基自由基消除率進(jìn)行相關(guān)性分析后的結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，總酚與DPPH自由基消除率具有顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），pH值、可滴定酸、乳酸、醋酸與羥基自由基消除率有顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），可見(jiàn)紫蘇葉酵素中的多酚類物質(zhì)與有機(jī)酸均具有一定的抗氧化活性[4]。乙醇與乳酸、醋酸呈現(xiàn)良好的相關(guān)性（P＜0.05），與可滴定酸、pH呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性（P＜0.01），這與發(fā)酵過(guò)程中微生物利用乙醇代謝成有機(jī)酸有關(guān)。

表2 紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)相關(guān)性Table 2 Correlation of various parameters during the Perilla leaves jiaosu fermentation

2.9 主成分分析

由相關(guān)性分析可知，紫蘇葉酵素各指標(biāo)變量間存在信息冗余，為了更好地研究紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物與抗氧化活性等綜合指標(biāo)信息，對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行降維處理，即主成分分析。

紫蘇葉酵素主成分的初始特征值及指標(biāo)變化對(duì)主成分的累積貢獻(xiàn)率見(jiàn)表3。由表3可知，以特征值1.0為納入標(biāo)準(zhǔn)，從影響紫蘇葉酵素的9種變量指標(biāo)中提取出2個(gè)主成分。紫蘇葉酵素的第1主成分（principal component 1，PC1）的方差貢獻(xiàn)率為58.903%，第2主成分的方差貢獻(xiàn)率為27.509%，前2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率高達(dá)86.413%，說(shuō)明前2個(gè)主成分能夠反映原始變量86.413%的信息，符合主成分分析的要求。因子載荷旋轉(zhuǎn)成分矩陣見(jiàn)表4。由表4可知，PC1反映了pH值、可滴定酸、乳酸、醋酸、乙醇和羥基自由基清除率的變異信息，PC2反映了總酚以及DPPH自由基清除率的變異信息。故通過(guò)降維獲得F1、F2來(lái)代替原先的9種變量指標(biāo)，為后續(xù)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算奠定基礎(chǔ)。

表3 主成分的初始特征值及指標(biāo)變量對(duì)主成分的累積貢獻(xiàn)率Table 3 Initial eigenvalues of the principal components and cumulative contribution rate of indicator variables to principal components

表4 因子載荷旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 4 Factor load rotation component matrix

不同發(fā)酵時(shí)間紫蘇葉酵素的CEI值見(jiàn)圖8。由圖8可知，發(fā)酵第63天CEI值最高為0.627，發(fā)酵第7天CEI值最低為-2.078。發(fā)酵前28 d，CEI值快速上升；在28～91 d時(shí)CEI值較為穩(wěn)定，稍有波動(dòng)；發(fā)酵91 d之后，CEI值逐漸下降。因此可判斷適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間有利于紫蘇葉酵素的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的上升。

圖8 發(fā)酵過(guò)程中紫蘇葉酵素綜合評(píng)價(jià)的變化Fig.8 Charges of comprehensive evaluation indexes of Perilla leaves jiaosu during fermentation process

3 結(jié)論

根據(jù)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)果，本研究將發(fā)酵過(guò)程分為三個(gè)階段：發(fā)酵前期（0～28 d）、發(fā)酵中期（28～91 d）、發(fā)酵末期（91～147 d）。發(fā)酵前期，紫蘇葉酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量、可滴定酸含量、乳酸含量、醋酸含量、乙醇含量、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率呈上升趨勢(shì)；發(fā)酵中期，總糖與乳酸、醋酸含量趨于穩(wěn)定，乙醇含量、可滴定酸、羥自由基清除率、總酚含量和DPPH自由基清除率緩慢上升且后兩者已于發(fā)酵63 d出現(xiàn)下降趨勢(shì)；發(fā)酵末期，紫蘇葉酵素中總酚、乳酸、醋酸等生物活性物質(zhì)含量開(kāi)始下降，抗氧化活性呈現(xiàn)輕微減弱趨勢(shì)。綜合考慮時(shí)間成本與CEI值，發(fā)酵至63d時(shí)CEI值達(dá)到最大，且發(fā)酵末期CEI值逐漸下降，故基本確定紫蘇葉酵素的發(fā)酵終點(diǎn)為63 d。