8個反季節(jié)秀珍菇菌株栽培性狀評價與遺傳差異分析

陳雪鳳，郎 寧，韋仕巖，吳圣進，王燦琴，吳小建，蘇啟臣，藍桃菊

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)在分類學(xué)上屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬、肺形側(cè)耳種，商品名或俗稱鳳尾菇。秀珍菇菌株類型繁多，根據(jù)出菇溫度分為高溫型品種和低溫型品種；根據(jù)出菇是否需要溫差刺激可分為自然出菇型秀珍菇和需要溫差刺激出菇的反季節(jié)秀珍菇。反季節(jié)秀珍菇即是通過制冷設(shè)施低溫溫差刺激，能在夏季出菇的秀珍菇品種。由于反季節(jié)秀珍菇有出菇整齊，潮次明顯，產(chǎn)量高，能根據(jù)市場需求量控制出菇，進行集約化栽培等諸多優(yōu)點，因此栽培規(guī)模逐年擴大。據(jù)2017年統(tǒng)計，廣西有30萬袋生產(chǎn)規(guī)模的企業(yè)約20多家，年產(chǎn)菌棒約2800萬袋，菌種需求量高達71萬袋。然而，目前廣西栽培的反季節(jié)秀珍菇種源比較混亂，交叉引種現(xiàn)象較多，異種同名或同種異名現(xiàn)象頻發(fā)，加上引種后擴繁不規(guī)范，造成質(zhì)量、產(chǎn)量和抗病性不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了更好的鑒別秀珍菇種源之間的親緣關(guān)系并篩選出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的反季節(jié)秀珍菇菌株，從分子生物學(xué)和傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀角度對不同來源的秀珍菇菌株進行綜合評價尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】有關(guān)秀珍菇品種篩選評價方面的研究報道較多。閆靜等[1]通過比較11個菌株的菌包污染率、菌絲長速、產(chǎn)量、子實體品質(zhì)等栽培特性，篩選出羅源秀珍、秀珍188、秀珍195等適合夏季設(shè)施化栽培的菌株。陸娜等[2]通過比較36個菌株的產(chǎn)量、子實體商品性狀、出菇密度、成品率等，篩選出產(chǎn)量高、菇體灰色、出菇密和成菇率表現(xiàn)好的秀57菌株。林原[3]通過比較10個菌株的生物學(xué)效率、農(nóng)藝性狀，篩選出菌蓋小厚，菌柄粗短、商品性好的秀63菌株。王燦琴等[4]通過比較13個菌株的菌絲的生長情況、栽培農(nóng)藝性狀、生物學(xué)效率、抗青霉等情況，篩選出表現(xiàn)較好的5個優(yōu)良菌株(HX13、HX14、HX10、HX8、HX9)。吳登等[5]通過比較7個秀珍菇菌株的菌絲體的生長情況、出菇溫度范圍、子實體經(jīng)濟性狀、產(chǎn)量等，篩選出適宜利用桑枝屑栽培的優(yōu)良菌株秀珍3號。由此可見，在秀珍菇品種篩選栽培評價中，多數(shù)科研者注重從產(chǎn)量、子實體商品性狀、菌絲生長方面進行秀珍菇菌株比較評價，但從菌絲生長后期是否吐黃水及黃斑病抗病性方面評價的較少。關(guān)于利用ISSR技術(shù)進行秀珍菇遺傳差異方面的研究，馮偉林等[6]利用ISSR技術(shù)開展15個秀珍菇多樣性分析，結(jié)果當(dāng)遺傳系數(shù)為0.87時菌株聚為3個群，同時初步發(fā)現(xiàn)秀珍菇不同出菇溫型與ISSR分子標(biāo)記分類有相關(guān)性。陸娜等[2]對36個秀珍菇菌株進行遺傳差異分析，結(jié)果36個秀珍菇菌株聚為7個群，遺傳差異較大。林原等[7]對7個秀珍菇菌株進行了ISSR遺傳分析，發(fā)現(xiàn)7個菌株存在一定的差異。由此可見ISSR技術(shù)可用作秀珍菇種內(nèi)菌株間的親緣性鑒定，但前人比較分析的秀珍菇菌株為廣泛收集的菌株，沒有針對性地對某一特性的秀珍菇菌株進行遺傳多樣性分析，且農(nóng)藝性狀與ISSR分子標(biāo)記相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)較少?！颈狙芯壳腥朦c】國內(nèi)有關(guān)秀珍菇品種選育、評價、遺傳多樣性分析的研究報道較多，但是專門針對需要溫差刺激出菇的反季節(jié)秀珍菇的種質(zhì)資源評價及遺傳多樣分析鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】結(jié)合菌絲生長、出菇情況、子實體性狀和抗病性進行菌株評價；通過菌株DNA的ISSR-PCR產(chǎn)物擴增檢測及聚類分析以判定菌株之間的親緣關(guān)系，綜合多個栽培性狀，篩選出表現(xiàn)較優(yōu)良的菌株，為栽培生產(chǎn)及育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與來源

供試菌株與來源見表1。

1.2 栽培培養(yǎng)料配方

栽培袋配方：棉籽殼20 %、桑枝30 %、木屑30 %、麥麩18 %、輕鈣1 %和石灰1 %。

PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、瓊脂20 g和水1000 mL。

1.3 試劑及引物

所用基因組DNA提取試劑盒、引物、PCR反應(yīng)體系和Marker DL 2000均購自康為世紀(jì)公司，所用引物的名稱及核苷酸序列見表2。8 % PAGE實驗試劑：29∶130 %雙甲叉丙烯酰胺、5XTBE、ddH2O、TEMED和10 %過硫酸銨。

1.4 出菇試驗

按栽培秀珍菇的常規(guī)方法生產(chǎn)菌包，使用17.00 cm×33.00 cm×0.05 cm的聚乙烯塑料袋裝袋，每個菌株接種100袋，設(shè)3個重復(fù)，菌袋接種后置于25～27 ℃培養(yǎng)室培養(yǎng)60 d，菌絲成熟后按常規(guī)方法進行出菇管理，出菇冷刺激溫度為10 ℃。

1.5 評價觀測方法

1.5.1 菌絲情況觀測 在秀珍菇菌絲菌齡為60和80 d時分別觀察菌包袋口附近菌絲是否吐黃水和出現(xiàn)自然出菇現(xiàn)蕾情況。

1.5.2 出菇情況觀測 觀察冷刺激后現(xiàn)蕾時間，出菇整齊度：冷刺激后2～3 d觀察，85 %以上的菌包現(xiàn)蕾出菇，而且菇蕾比較整齊且多，為整齊(+++)；50 %～85 %菌包現(xiàn)蕾，但菇蕾不整齊，菇蕾少，為一般整齊(++)；30 %～50 %菌包現(xiàn)蕾，但菇蕾不整齊，菇蕾少，為不整齊(+)；30 %以下的菌包現(xiàn)蕾或不現(xiàn)蕾且菇蕾少，為難出菇(0)。采收前4～5潮菇，計算生物學(xué)轉(zhuǎn)化率(%)=(鮮菇重/干料重)×100，并進行統(tǒng)計分析。

表1 供試秀珍菇菌株

表2 ISSR引物序列

1.5.3 子實體性狀觀測 第1潮菇采收時，每個品種隨機抽取30～50朵鮮菇，進行子實體性狀測定。子實體厚度：用游標(biāo)卡尺測量菌蓋中心厚度。子實體菌蓋大?。河糜螛?biāo)卡尺“十”字形測量菌蓋直徑；菌柄直徑：測量菌柄中部直徑。菌柄長度：測量菌褶與菌柄交界處至菌柄基部的距離；子實體顏色深淺度：灰褐色、灰黑色和灰白色。

1.5.4 黃斑病發(fā)病情況調(diào)查和分級標(biāo)準(zhǔn) 第1潮菇采收前，統(tǒng)計全部菌包的黃斑病發(fā)病率—即統(tǒng)計全部出菇袋數(shù)，并統(tǒng)計有黃斑病發(fā)生的袋數(shù)。每個品種隨機調(diào)查15袋3個重復(fù)，每個重復(fù)5袋子實體，調(diào)查直徑1.5 cm以上的全部子實體病情情況，病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)見表3。根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)計算病情指數(shù)[8-9]。

1.6 遺傳差異分析

1.6.1 菌絲培養(yǎng)與DNA提取 將不同菌株的菌絲塊接種到PDA加富培養(yǎng)基的平皿上，于27 ℃培養(yǎng)6～8 d，用解剖刀刮取菌絲。使用DNA提取試劑盒對收集的菌絲進行DNA提取，并用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，質(zhì)量合格的DNA儲藏于-20 ℃冰箱備用。

1.6.2 ISSR-PCR擴增及電泳 試驗用ISSR引物見表2所示，PCR擴增反應(yīng)體系(25 μl)：2×EsTaqMasterMix(Dye) 12 μl，ddH2O 11 μl，引物 (10 μmol/L) 1 μl，DNA模板1 μl。按上述比例將反應(yīng)液加入PCR管并混合均勻，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，45～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃終延伸10 min，16 ℃保存30 min。 PCR產(chǎn)物在8 % PAGE膠上120 V，5.0 h電泳檢測。

1.6.3 銀染 電泳結(jié)束后，自來水沖洗玻璃板兩面，預(yù)冷，剝下凝膠，雙蒸水洗滌2次。將PAGE膠浸沒于0.1 % 的AgNO3溶液中，搖床銀染10 min，然后用雙蒸水沖洗2次，每次不超過10 s。再將PAGE膠浸沒于1.2 % NaOH+ 0.4 %甲醛溶液中顯影，看到模糊的條帶后立即用大量雙蒸水沖洗，中止顯影。

1.6.4 數(shù)據(jù)分析 將ISSR圖譜用掃描儀掃描并進行ISSR擴增片段統(tǒng)計，有ISSR帶譜記為1，無ISSR帶譜記為0，用聚類分析軟件NTSYS-PC 2.1計算遺傳相關(guān)系數(shù)，進行聚類分析，得出聚類圖譜。

表3 秀珍菇黃斑病的分級標(biāo)準(zhǔn)

注：病情指數(shù)(K)公式為：K={∑[k1×n1]/(n×k2)}×100，式中：k1為病害級數(shù)值；n1為對應(yīng)各級發(fā)病子實體數(shù)；n為調(diào)查總子實體數(shù)；k2為病害最高級數(shù)值。

Note: Disease index(K)={∑[k1×n1]/(n×k2)}×100.k1is the representative value of disease;n1is the quantity of the fruit body corresponding to each grade of disease;k2is the highest value of the grade disease.

表4 8個供試秀珍菇菌株栽培出菇情況對比

注：同列數(shù)據(jù)中大寫字母表示不同菌株在0.01水平上差異顯著，下同。

Note: Capital letters in the same row indicate significant difference at 1 % level among different strains. The same as below.

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀評價

2.1.1 菌絲及出菇情況 從菌絲生長后期是否吐黃水來看，只有臺秀2號容易吐黃水，其余7個菌株后期沒有吐黃水；從是否需要大溫差刺激出菇方面來看，秀珍12菌包長滿后氣溫低于25 ℃以下就可以自然出菇，而其他菌株則需要有較低的溫度刺激方能出菇；在正常出菇管理下觀察8個菌株黃斑病的自然發(fā)生情況發(fā)現(xiàn)：秀珍P-4發(fā)病最為嚴(yán)重，發(fā)病率為58.53 %，說明其抗黃斑病能力較差，其他7個菌株發(fā)病率較低；從冷刺激后現(xiàn)蕾快慢來看，臺秀57(農(nóng))、臺秀2號、秀珍P-4、臺秀(天達)、廣溫秀珍現(xiàn)蕾較快，需2.5 d；秀珍P-6、秀珍12、秀珍13現(xiàn)蕾稍慢，需要2.5～3 d。出菇最整齊是臺秀57(農(nóng))、臺秀2號、臺秀(天達)和廣溫秀珍，其次是秀珍P-4、秀珍P-6、秀珍13，整齊度最差的是秀珍12；從生物學(xué)轉(zhuǎn)化率方面分析，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率最高的是臺秀(天達)，為73.67 %，其次是臺秀57(農(nóng))，轉(zhuǎn)化率為68.93 %，最差的是秀珍P-4，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率只有25.90 %。綜合以上情況的分析比較，可以淘汰吐黃水的臺秀2號、容易自然出菇、出菇不整齊的秀珍12和產(chǎn)量低抗病差的秀珍P-4(表4)。

2.1.2 子實體主要性狀 8個秀珍菇菌株子實體顏色大致分為灰黑色、灰褐色和灰白色3類，其中灰黑色菌株4個，灰褐色菌株1個，灰白色菌株3個；子實體厚度、菌柄直徑可分為3類：菌蓋厚、菌柄粗的臺秀57(農(nóng))等4個菌株為一類，菌蓋薄、菌柄細(xì)的秀珍12為一類，其余的3個菌株為一類；子實體單個重量基本上與菌蓋厚度、菌柄粗細(xì)及菌蓋直徑正相關(guān)。結(jié)合市場需求，顏色深的灰黑色品種，以及菌蓋厚的品種較受歡迎，因此可淘汰秀珍12、秀珍13、秀珍P-4。而臺秀(天達)除了顏色稍微偏白外，其他各項性狀均優(yōu)良，因此可以作為今后的育種材料(表5)。

表5 供試8個秀珍菇菌株子實體性狀對比

M、1、2、3、4、5、6、7、8分別代表Marker DL 2000、秀珍 12、臺秀 57(農(nóng))、秀珍 P-6、廣溫秀珍、秀珍 P-4、秀 珍13、臺秀(天達)、臺秀 2 號M,1,2,3,4,5,6,7,8 respectively represent Marker DL 2000, Xiuzhen12, Taixiu57nong, Xiuzhen P-6, Guangwenxiuzhen, Xiuzhen P-4, Xiuzhen13, Taixiutianda and Taixiu2圖1 引物7、8、9、11、12、27、34、36、42對秀珍菇8個供試菌株擴增的ISSR電泳圖譜Fig.1 ISSR electrophoretogram of tested strains of P. pulmonarius based on primers 7, 8, 9, 11, 12, 27, 34, 36 and 42

2.2 秀珍菇ISSR標(biāo)記分析

2.2.1 電泳圖譜統(tǒng)計分析 使用18個ISSR通用引物對8個秀珍菇菌株進行分析，共計擴增出361條清晰易辯的條帶，擴增的DNA片段條帶的大小為150～2000 bp，多態(tài)性片段為304條，多態(tài)性比例為84.21 %。其中引物7、8、9、11、12、27、34、36和42擴增片段如圖1所示。

2.2.2 DNA擴增圖譜聚類分析 秀珍菇菌株的遺傳關(guān)系圖譜見圖2。由ISSR聚類圖上可以看出8個菌株遺傳相似性水平為0.59～0.77，在0.59水平上8個菌株聚為2個群，秀珍12單獨為一類，其他7個菌株為一類，說明秀珍12其他7個菌株親緣關(guān)系較遠。系數(shù)為0.68時為4個群，秀珍12為GroupⅠ；臺秀57(農(nóng))、臺秀2號和廣溫秀珍為Group Ⅱ；秀珍P-6為Group Ⅲ；秀珍P-4、臺秀(天達)和秀珍13為Group Ⅳ。但系數(shù)為0.77時臺秀57(農(nóng))與臺秀2號為一組，說明8個菌株中臺秀57(農(nóng))與臺秀2號遺傳關(guān)系最近。

3 討 論

3.1 秀珍菇菌株遺傳多樣性

種質(zhì)資源遺傳多樣性是農(nóng)藝性狀、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)及分子遺傳標(biāo)記等方面多樣性的綜合體現(xiàn)[10]。秀珍菇在栽培過程中，常常會受到溫度、光照等因素的影響，外觀形態(tài)出現(xiàn)差異，傳統(tǒng)的子實體形態(tài)容易受環(huán)境因素影響，品種菌株間難以區(qū)分。而ISSR檢測手段簡單、高效，常用于揭示食用菌遺傳多態(tài)性和區(qū)分種內(nèi)菌株間親緣關(guān)系，是一種快速、可靠的工具[11]。馮偉林等[6]、 陸娜等[2]和林原等[7]利用ISSR技術(shù)對其所收集的菌株開展秀珍菇多樣性分析，均得出菌株之間存在一定的差異。但3位研究者所研究的秀珍菇菌株是廣泛收集的秀珍菇菌株，并沒有針對性地對某一類秀珍菇菌株進行多樣性分析。在農(nóng)藝性狀與ISSR分子標(biāo)記相關(guān)性上，只有馮偉林等發(fā)現(xiàn)農(nóng)藝性狀中出菇溫度與ISSR分子標(biāo)記有相關(guān)性。本研究利用ISSR技術(shù)對8個秀珍菇菌株開展多樣性研究分析，根據(jù)菌株DNA的擴增片段進行聚類分析，8個菌株遺傳相似性水平為0.59～0.77，得出菌株之間遺傳有差異，在遺傳相似系數(shù)0.59時8個菌株聚為2個群，即不需要大溫差刺激出菇的秀珍12單獨為一類，其他7個需要大溫差刺激出菇的菌株為另一類，說明這兩類菌株親緣關(guān)系較遠?？梢奍SSR分子技術(shù)能明顯將需要大溫差刺激出菇的品種與不需要溫差刺激的品種區(qū)分出來，說明出菇溫差型與ISSR分子標(biāo)記分類相關(guān)性較高，這與馮偉林發(fā)現(xiàn)的“秀珍農(nóng)藝性狀中出菇溫度與ISSR分子標(biāo)記有相關(guān)性” 的研究結(jié)果相近。本研究還發(fā)現(xiàn)，遺傳系數(shù)為0.68時，秀珍P-4、秀珍13、臺秀(天達)3個灰白色菌株聚為一類，這說明秀珍菇的顏色農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記也有一定的相關(guān)性，但具體情況還有待研究。

圖2 以18個ISSR引物擴增的8個秀珍菇菌株聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis diagram of the tested 8 P. pulmonarius strains based on 18 ISSR primers

3.2 秀珍菇菌株農(nóng)藝性狀比較

創(chuàng)造優(yōu)良性狀，特別是聚合多個優(yōu)異農(nóng)藝性狀是育種的主要目標(biāo)。食用菌農(nóng)藝性狀的好壞能直接反映出菌株是否優(yōu)良。在實際工作中，科研生產(chǎn)者最為關(guān)注的農(nóng)藝性狀是豐產(chǎn)性、抗逆性、菌絲長勢、適應(yīng)性及子實體的商品性狀(顏色、外形和質(zhì)地)等相關(guān)性狀[11]。閆靜等[1]、陸娜等[2]、林原等[3]及王燦琴等[4]從菌絲長勢、產(chǎn)量、子實體商品性等方面進行秀珍菇菌株農(nóng)藝性狀的比較，篩選較好的菌株[1-4]。陳麗新等[12]、曹本雄等[13]、吳登等[5]從基質(zhì)適應(yīng)性方面進行菌株的比較，篩選出適合桉樹皮、桑枝屑、木薯桿屑栽培的秀珍菇菌株。而本研究則根據(jù)市場及栽培者的需求，除了從產(chǎn)量、出菇快慢、整齊度和子實體商品性狀進行農(nóng)藝性狀比較外，還從菌絲后期是否容易吐黃水、黃斑病抗病性等抗逆性方面進行比較評價，篩選出優(yōu)良菌株。

抗逆性是食用菌優(yōu)良品種必備的重要性狀，它直接關(guān)系到栽培的成敗和經(jīng)濟效益[11]?？鼓嫘园共⌒浴⒖瓜x性、抗高溫性、耐堿性等。反季節(jié)秀珍菇在栽培中很容易發(fā)生黃斑病。秀珍菇感染黃斑病后，子實體變黃、腐爛，出現(xiàn)黏稠狀分泌物，伴有惡臭味，并蔓延至整叢子實體，使得產(chǎn)品失去商品價值。據(jù)調(diào)查，頭潮菇黃菇病發(fā)生率一般為9.4 %～20.8 %，高的達62.6 %，嚴(yán)重的甚至整個菇房100 %菌包發(fā)病[14]。因此黃斑病抗性應(yīng)作為秀珍菇的農(nóng)藝性狀評價的一個重要性狀指標(biāo)。但在秀珍菇種源評價中，對抗病性的比較評價鮮有報道。本研究采取發(fā)病率及病情指數(shù)雙重評價指標(biāo)對供試菌株黃斑病的發(fā)病程度進行評判，更加科學(xué)可靠。對于秀珍菇黃斑病，目前國內(nèi)沒有該病害調(diào)查的分級標(biāo)準(zhǔn)，本研究通過參考農(nóng)作物病害的分級方法結(jié)合秀珍菇黃斑病發(fā)生特點，制定了黃斑病調(diào)查方法。該方法將有助于今后進行秀珍菇黃斑病的抗病性鑒定評價。

4 結(jié) 論

通過品比試驗及遺傳多樣分析，綜合產(chǎn)量、菇體顏色、感黃斑病、菌絲吐黃水等情況，初步選出各項栽培性狀均表現(xiàn)較好的臺秀57(農(nóng))菌株，可以進行栽培推廣；秀珍P-6、廣溫秀珍、臺秀(天達)菌株可做育種材料。