藏山羊AQP7基因克隆和不同組織器官差異表達(dá)分析

張亞楠，王 永,，朱江江，許 晴，林亞秋*

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部、四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

【前人研究進(jìn)展】水通道蛋白7(aquaporin 7，AQP7)是1997年Ishibashi K等[1]在大鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)甘油穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的成孔跨膜蛋白，屬于水通道蛋白(AQPs)家族中的重要成員。目前為止，研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白家族成員共有13個(gè)，即AQP0-APQ12，按功能可分為只轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的AQPs、既可轉(zhuǎn)運(yùn)水分子又可轉(zhuǎn)運(yùn)甘油的水甘油通道和其功能尚未闡明的超AQPs三個(gè)亞家族[2]，而AQP7是一類(lèi)水甘油通道蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，AQP7能控制脂肪細(xì)胞中脂肪源甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)，其缺乏可降低質(zhì)膜甘油通透性，減少血漿甘油，同時(shí)可提高脂肪細(xì)胞甘油激酶活性和促進(jìn)甘油三酯的合成，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油和甘油三酯的蓄積，從而增加脂肪細(xì)胞體積和脂肪組織質(zhì)量[3-7]。同時(shí)體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AQP7在體內(nèi)控制胰島β細(xì)胞數(shù)量和胰島素分泌方面起著關(guān)鍵作用[8]。胰島素刺激體外人網(wǎng)膜脂肪組織可增加AQP7蛋白表達(dá)，但是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑可抑制這種現(xiàn)象[9]。與之相反，異丙腎上腺素是一種選擇性的β-激動(dòng)劑，它能刺激脂肪分解，降低AQP7的豐度[10]?！狙芯恳饬x】藏山羊是我國(guó)具有4000多年飼養(yǎng)歷史的特有珍稀畜種，其主要分布在海拔1500～5000 m的青藏高原、四川西部、甘肅等地，是藏區(qū)人民重要的生活和生產(chǎn)資料，同時(shí)藏山羊耐粗飼, 抗逆性強(qiáng), 肌肉細(xì)嫩，風(fēng)味好[11]。因而提高藏山羊甘油轉(zhuǎn)運(yùn)能力有助于增加其脂肪含量從而提高其肉質(zhì)，而目前對(duì)AQP7的研究主要集中于人、大鼠、牛和豬等哺乳動(dòng)物中，尚未見(jiàn)在山羊中的相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此本試驗(yàn)擬通過(guò)RT-PCR方法克隆藏山羊AQP7基因序列，并對(duì)序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(quantitative Real-time PCR，qPCR)闡明其在藏山羊各組織中的表達(dá)模式?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為進(jìn)一步研究該基因在藏山羊脂代謝中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用試驗(yàn)動(dòng)物為來(lái)自四川省若爾蓋種羊場(chǎng)的2.5歲健康雄性藏山羊(n=3)，現(xiàn)場(chǎng)屠宰后活體采集各個(gè)樣本(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌)，迅速置于液氮中保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 試劑

Trizol試劑盒、pMD-19T載體與熒光定量試劑盒SYBRPremix ExTaq(2×)均購(gòu)自大連TaKaRa公司, 2×LongTaqPCR Master Mix、感受態(tài)細(xì)胞DH5α和DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit)均購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購(gòu)自Thermo公司(美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 藏山羊AQP7基因克隆 采用Trizol法提取藏山羊脂肪組織的總RNA，并合成cDNA。根據(jù)GenBank上登陸的牛AQP7基因序列(NM_001076378)，利用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因克隆引物(表1)。25 μl PCR擴(kuò)增體系： 2×GC-Rich PCR MasterMix 12.5 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 9.5 μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性(94 ℃，3 min)，變性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，1 min 10 s)，延伸(72 ℃，1 min)，35個(gè)循環(huán)，延伸(72 ℃，10 min)。2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收純化目的片段，然后將純化的目的片段與pMD-19T載體16 ℃連接2 h，并轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)胞中，氨芐抗性平板挑選陽(yáng)性菌落并進(jìn)行菌液PCR鑒定，最后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3.2 藏山羊AQP7基因生物信息學(xué)分析 蛋白理化性質(zhì)采用ExPASy ProtParam分析；DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)；磷酸化位點(diǎn)、O糖基化位點(diǎn)、N糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetPhos3.1、NetOGlyc1.0和NetNGlyc 3.1分析；信號(hào)肽應(yīng)用SignaIP 4.1 Server進(jìn)行分析，跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM預(yù)測(cè)，亞細(xì)胞定位采用PSORTII進(jìn)行分析；結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)利用NCBI的Conserved Domain程序進(jìn)行；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別運(yùn)用PRABI、Swiss-model進(jìn)行；同源性分析采用NCBI中Blast進(jìn)行，進(jìn)化樹(shù)使用clustalx 1.83和MEGA5.0構(gòu)建。

1.3.3 藏山羊AQP7基因組織表達(dá)分析 提取藏山羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌等組織的總RNA，并合成cDNA，根據(jù)克隆測(cè)序獲得的AQP7基因序列和3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因設(shè)計(jì)特異引物，并利用qPCR技術(shù)檢測(cè)AQP7在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和臂三頭肌中的相對(duì)表達(dá)情況。20 μl反應(yīng)體系: SYBR?Premix ExTaqTM(2×)10 μl，cDNA 1 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，RNase Freed H2O 7 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，39個(gè)循環(huán)，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)2個(gè)重復(fù)。用2-ΔΔCt法計(jì)算熒光定量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏山羊AQP7 基因克隆

以藏山羊脂肪組織cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增及2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得預(yù)期相符的目的片段條帶，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序后獲得AQP7基因序列全長(zhǎng)1119 bp，包含CDS區(qū)序列993 bp，5’ UTR序列54 bp和3’ UTR序列72 bp，終止密碼子為T(mén)AA，編碼330個(gè)氨基酸。

表1 引物信息

注：S：正義鏈引物；A：反義鏈引物；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶。

Note：S: Sense primer; A: Antisense primer; GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

2.2 藏山羊AQP7基因理化性質(zhì)分析

利用ExPASy ProtParam分析藏山羊AQP7蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，藏山羊AQ7蛋白總原子數(shù)為5082，其分子式為C1648H2548N422O447S17，分子量為35.969 kDa，理論等電點(diǎn)為9.2，說(shuō)明該蛋白呈堿性。帶正電的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為24，帶負(fù)電的殘基總數(shù)(Asp + Glu)為18，其不穩(wěn)定系數(shù)為35.77，親水性平均值為0.335，說(shuō)明該蛋白為穩(wěn)定疏水蛋白。

2.3 藏山羊AQP7基因序列分析

通過(guò)DNAMAN比對(duì)藏山羊和山羊預(yù)測(cè)序列(XM_005684061.3)AQP7基因核苷酸與氨基酸序列同源性發(fā)現(xiàn)，藏山羊與山羊核苷酸同源性分別為99 %，其氨基酸同源性為100 %。檢測(cè)到堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致密碼子由TCA變?yōu)門(mén)CG，而比對(duì)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸沒(méi)有突變。

通過(guò)NetPhos3.1、NetOGlyc1.0和NetNGlyc 3.1預(yù)測(cè)其磷酸化位點(diǎn)、O糖基化位點(diǎn)和N糖基化位點(diǎn)，結(jié)果顯示藏山羊AQP7蛋白共有31個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸(Ser)位點(diǎn)16個(gè)，蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)13個(gè)，酪氨酸(Tyr)位點(diǎn)2個(gè)，8個(gè)潛在O糖基化位點(diǎn)和4個(gè)潛在N糖基化位點(diǎn)。SignaIP 4.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其無(wú)信號(hào)肽序列，TMHMM結(jié)果顯示其含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，PSORT II亞細(xì)胞定位顯示其主要在質(zhì)膜(47.8 %)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(21.7 %)和液泡(17.4 %)中發(fā)揮作用，STRING分析其蛋白質(zhì)互作，顯示其與AQP6、AQP8、STK4、AQP11、GK、GK2、GK5等存在相互作用(圖1)，同時(shí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示其含有一個(gè)主要內(nèi)在蛋白(MIP)結(jié)構(gòu)域。

通過(guò)PRABI軟件預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，其主要有α-螺旋，延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)，其有62個(gè)氨基酸可能形成阿爾法螺旋，93個(gè)氨基酸可能形成延伸鏈和175個(gè)氨基酸可能形成無(wú)規(guī)則卷曲。

圖1 藏山羊AQP7蛋白互作Fig.1 Tibetan goat AQP7 protein interaction

2.4 藏山羊AQP7基因氨基酸同源性分析及構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

通過(guò)NCBI在線(xiàn)比對(duì)氨基酸同源性發(fā)現(xiàn)藏山羊和山羊(XP_005684118)、綿羊(XP_004004192.1)、牛(NP_001069846.1)、虎皮鸚鵡(XP_005143221.1)、豬(NP_001106909.1)、人(NP_001161.1)、野鴨(XP_021131239.1)、羊駝(XP_006216905.1)、獼猴(XP_001100020.1)、家犬(XP_013973284.1)、貓(XP_006939273.1)、斑馬魚(yú)(NP_956204.2)、綠海龜(XP_007063361.1)、家鼠(NP_031499.1)，其同源性分別為100 %、99 %、93 %、54 %、77 %、72 %、52 %、78 %、71 %、75 %、76 %、51 %、55 %、71 %。其進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明藏山羊與山羊親緣性最近(圖2)。

圖2 NJ法構(gòu)建藏山羊AQP7氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Construction of phylogenetic tree of AQP7 amino acid system of Tibetan goats by NJ method

n=3；不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)n=3;Different superscript lowercase and capital letters respectively showed significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), no obvious difference is indicated by the same letter(P>0.05)圖3 AQP7 mRNA在藏山羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression levels of AQP7 mRNA in different tissues of Tibetan goats

2.5 藏山羊AQP7基因組織表達(dá)分析

組織表達(dá)結(jié)果顯示(圖3)，AQP7基因在藏山羊各組織中均有表達(dá)，其在脂肪和腎臟組織中的表達(dá)量最高，均極顯著高于其他組織(P<0.01)，其次在心臟組織中表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)。

3 討 論

近年來(lái)，深入研究肌內(nèi)脂肪調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn)提高肌內(nèi)脂肪含量有助于提高肉的嫩度及多汁性，因此如何提高肌內(nèi)脂肪含量成為研究人員所關(guān)注的熱點(diǎn)。而闡明肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制對(duì)動(dòng)物肉品質(zhì)的改善具有重要的理論與實(shí)際意義。前人研究表明AQP7基因與脂代謝相關(guān)，因此引起了本實(shí)驗(yàn)室的興趣，而獲得基因序列和闡明其組織表達(dá)是研究其功能的基礎(chǔ)，因此本研究擬克隆獲得藏山羊AQP7基因序列和闡明其組織表達(dá)譜，進(jìn)一步揭示AQP7基因在藏山羊脂質(zhì)代謝中的作用提供理論基礎(chǔ)。

本研究獲得AQP7基因序列全長(zhǎng)1119 bp，包含CDS區(qū)序列993 bp，編碼330個(gè)氨基酸，AQP7含有一個(gè)主要內(nèi)在蛋白(MIP)結(jié)構(gòu)域。序列分析顯示，藏山羊AQP7蛋白共有31個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，其中潛在絲氨酸(Ser)位點(diǎn)16個(gè)，潛在蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)13個(gè)，潛在酪氨酸(Tyr)位點(diǎn)2個(gè)，8個(gè)潛在O糖基化位點(diǎn)和4個(gè)潛在N糖基化位點(diǎn)，這可能與蛋白質(zhì)翻譯后修飾有關(guān)[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)AQP7蛋白主要存在于質(zhì)膜中，劉慶雙等[13]對(duì)大鼠睪丸AQP7 mRNA與蛋白質(zhì)的定位也發(fā)現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象，而Kuriyama H等[14]發(fā)現(xiàn)人類(lèi)AQP7具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)AQP7蛋白含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明AQP7主要在質(zhì)膜中發(fā)揮作用，因而其無(wú)信號(hào)肽序列。通過(guò)比較藏山羊與山羊CDS序列，存在一個(gè)同義突變。同時(shí)與綿羊和牛CDS序列相比，分別存在3個(gè)和22個(gè)錯(cuò)義突變。氨基酸的改變導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其三級(jí)結(jié)構(gòu)也證實(shí)其二級(jí)結(jié)構(gòu)在其之間存在差異，表明AQP7蛋白在不同物種間可能存在差異，而氨基酸改變導(dǎo)致其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是否會(huì)引起其功能的變化以及在不同物種間的功能是否有變化仍需進(jìn)一步證明。

組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，AQP7在藏山羊各組織中均呈不同程度的表達(dá)，其中在脂肪組織和腎臟中表達(dá)水平最高，這可能與AQP7在脂肪組織中促進(jìn)甘油跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及在腎臟中對(duì)甘油的重吸收有關(guān)[15-16]。Kishida等[17]研究發(fā)現(xiàn)AQP7在小鼠骨骼肌中少量表達(dá)，這與本研究結(jié)果相似。王宏麗等[18]發(fā)現(xiàn)高脂肪飲食小鼠脂肪組織AQP7表達(dá)下調(diào)，而且其體重及主要脂肪組織增重明顯。Hibuse T等[19]研究發(fā)現(xiàn)AQP7缺乏小鼠心肌甘油消耗和ATP含量顯著降低，提示AQP 7在心肌甘油代謝和ATP生成中具有調(diào)控作用。同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肥胖瘦素缺乏ob/ob小鼠骨骼肌AQP7表達(dá)與WT小鼠相比顯著增加[3]，表明AQP7可通過(guò)多種分子機(jī)制調(diào)控脂質(zhì)代謝。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果即AQP7在藏山羊脂肪組織中的高水平表達(dá)，結(jié)合上述在小鼠等模式生物中的研究，推測(cè)AQP7可能在藏山羊的脂代謝、脂肪沉積中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但具體的調(diào)控作用及可能的機(jī)制則需進(jìn)一步研究來(lái)闡明。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆包含完整CDS區(qū)序列的藏山羊AQP7基因序列1119 bp，具有跨膜結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽，主要在質(zhì)膜中發(fā)揮作用；組織表達(dá)譜表明AQP7基因廣泛表達(dá)于藏山羊各組織中，其在脂肪組織和腎臟組織中表達(dá)水平最高。本試驗(yàn)結(jié)果為研究AQP7基因在藏山羊脂代謝中的作用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。