圍產(chǎn)期孕婦感染B族鏈球菌耐藥性及相關(guān)耐藥基因檢測

【摘 要】目的：調(diào)查孕晚期婦女感染B族鏈球菌（GBS）耐藥性以及相關(guān)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的表達(dá)情況。方法：K-B紙片擴(kuò)散法檢測GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥性，再以D試驗檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥表型。紅霉素和克林霉素耐藥基因用PCR方法檢測。結(jié)果：未發(fā)現(xiàn)萬古霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢克肟耐藥菌株，紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、氯霉素的耐藥率依次為74.19%、58.06%、77.2%、35.48%。青霉素有1例中介、1例耐藥。ermB基因為主要的紅霉素耐藥基因，占51.61%。兩種erm基因同時陽性占16.13%，有1株含erm B基因，但對紅霉素敏感。所有的紅霉素耐藥菌株中未檢出ermA、ermC基因。結(jié)論：青霉素仍可作為預(yù)防和治療GBS感染的首選藥物，紅霉素和克林霉素作為替代藥物表現(xiàn)出較高的耐藥性和交叉耐藥。ermB編碼的核糖體修飾是導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的主要機(jī)制。因此臨床醫(yī)生針對青霉素過敏，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的患者應(yīng)及時根據(jù)藥敏合理選擇抗生素，避免重復(fù)選擇大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽霉素B（MLSB）類抗菌藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

【關(guān)鍵詞】B族鏈球菌;耐藥性;耐藥基因

B群鏈球菌（group B streptococci，GBS），又稱無乳鏈球菌，是新生兒肺炎、腦膜炎、菌血癥的主要病原菌，圍產(chǎn)期孕婦感染可導(dǎo)致早產(chǎn)、胎膜早破、晚期流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[1，2]。目前治療GBS感染主要使用β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物，隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用顯著增加，我國GBS對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物尤其是紅霉素的耐藥問題也日趨嚴(yán)重，本研究旨在了解本地區(qū)GBS耐藥性及相關(guān)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的表達(dá)，為臨床治療GBS提供指導(dǎo)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：采集2016年9月至2017年2月于我院就診的35-37周妊娠晚期孕婦宮頸和直腸捻拭子，所有標(biāo)本經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、CAMP試驗、促酶試驗鑒定后共收集GBS陽性菌株31株。

1.2 藥敏試驗

參照2013年美國臨床及實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI）說明，采用K-B紙片擴(kuò)散法測定GBS菌株對常用抗菌藥物的敏感性;D試驗法方法檢測克林霉素誘導(dǎo)（MLSB）耐藥表型。M-H瓊脂及抗菌藥物紙片購自南京茂捷微生物科技有限公司。金黃色葡萄球菌AT25923為質(zhì)控菌株。

1.3 耐藥基因檢測

以PCR法檢測耐藥基因ermA、ermB、ermC、ermTR、mefA、linB。PCR反應(yīng)總體系為20μL，包括10×PCR Mix 10μL，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，用ddH2O補足至20μl。引物由上海生工生物工程有限公司合成，Taq PCR MasterMix（含染料）、qPCR反應(yīng)液和DNA標(biāo)記物DL2000均購自Biomed公司產(chǎn)品。具體引物序列及PCR反應(yīng)條件。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用世界衛(wèi)生組織細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)提供WHONET5軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、氯霉素的耐藥率依次為74.19%、58.06%、77.2%、35.48%。萬古霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢克肟100%敏感，青霉素有1例中介、1例耐藥。

2.2 D實驗結(jié)果

cMLS表型為主要耐藥表型，占54.84%（17/31），檢出M型6株，L型1株，未檢出iMLS表型。

2.3 耐藥基因結(jié)果

紅霉素耐藥基因以erm基因為主，其中ermB15株，ermTR基因6株。同時表達(dá)ermB和ermTR基因的有5株，同時表達(dá)ermB、ermTR和mef或者ermB、ermTR和linB基因有4株。所有標(biāo)本均未檢出ermA及ermC基因?？肆置顾卣T導(dǎo)耐藥表型與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因陽性的關(guān)系。

3 討論

GBS又稱無乳鏈球菌，是定植于患者胃腸道及泌尿生殖道常見的條件致病菌，圍產(chǎn)期感染可導(dǎo)致多種不良母嬰后果，因此篩查GBS帶菌率，降低圍產(chǎn)期GBS感染發(fā)生率和危害成為世界各國都重視的問題。我國在《孕前和孕期保健指南（第一版）》中也已明確將妊娠35～37周GBS篩查作為備查項目。

美國疾病控制中心（CDC）最新指南提出青霉素為治療和預(yù)防GBS的首選藥物，如對青霉素過敏，可選擇頭孢類抗生素，或選擇紅霉素或克林霉素替代[3]。目前紅霉素和克林霉素耐藥呈全球分布，而且有不斷升高趨勢。韓國在1995-2013年期間收集在三個不同區(qū)域的醫(yī)院所獲得的新生兒GBS分離株，所有菌株對青霉素敏感紅霉素和克林霉素耐藥率分別為51.8%和55.4%。相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)深圳地區(qū)GBS對紅霉素、克林霉素的耐藥率分別為69.71%、64.86%，且2012-2015年耐藥率逐年上升。本實驗中紅霉素、克林霉素耐藥率分別為74.19%、58.06%，與國內(nèi)多位學(xué)者的研究相近，明顯高于南非、伊朗的研究數(shù)據(jù)。不同國家及地區(qū)的大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率存在差異可能與地區(qū)及人種差異有關(guān)。產(chǎn)前及產(chǎn)時預(yù)防性使用抗生素增加了大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥率，對青霉素過敏患者臨床應(yīng)根據(jù)藥物試驗結(jié)果及時調(diào)整用藥方案，減少菌株耐藥性的產(chǎn)生。本實驗青霉素多數(shù)對GBS敏感，但有1例中介、1例耐藥。日本和香港也有類似報道，說明青霉素仍可作為治療GBS的首選藥物，但其敏感度降低的趨勢需要引起重視和關(guān)注。

GBS對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的機(jī)制主要有兩方面，一是由mef基因編碼的特異大環(huán)內(nèi)酯類外排機(jī)制增強;二是erm基因通過編碼的核糖體甲基化酶使23S r RNA甲基化，使大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物靶位發(fā)生變化，導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽霉素B類抗菌藥物（MLSB）與細(xì)菌核糖體靶位的結(jié)合力下降，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性或誘導(dǎo)性耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)對紅霉素耐藥的GBS菌株主要耐藥表型為cMLS表型，耐藥基因為ermB（69.56%）。有16.12%的菌株同時檢出了ermB和ermTR兩種基因。同時表達(dá)ermB、ermTR和mef或者ermB、ermTR和linB三種基因的有4株。相關(guān)文獻(xiàn)研究認(rèn)為紅霉耐藥性主要與基因ermB、ermB-mefA（E）有關(guān)。最主要的表型為CMLS，占77.8%。有關(guān)文獻(xiàn)從2008年到2013年收集了40例GBS分離株。在紅霉素耐藥菌株中73.0%僅攜帶ermB基因，5.4%攜帶mefA基因，21.6%表達(dá)ermB和mefA基因。此外38%的分離株檢測到ermB和linB基因，mefA基因介導(dǎo)的外排泵也分布。多項研究提示GBS耐藥是ermB介導(dǎo)核糖體靶位改變能起主導(dǎo)，多種耐藥機(jī)制共同作用的過程。本研究有1株GBS不含上述紅霉素耐藥基因的任何一種基因，但仍對紅霉素耐藥，說明可能還有其他的機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，青霉素類和頭孢菌素類藥物對GBS敏感性高，仍為首選推薦方案，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物作為備選藥物耐藥率逐年上升，同時檢出的耐藥基因種類增多。ermB編碼的核糖體修飾是導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的主要機(jī)制，臨床醫(yī)生在抗生素選擇時應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理選擇，避免重復(fù)選擇MLSB類抗菌藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)

[1]應(yīng)群華，嚴(yán)文衛(wèi)，丁金龍.圍產(chǎn)期生殖道菌群檢測和B群鏈球菌篩查[J].中國微生態(tài)雜志，2006，18（6）：491-492.

[2]朱敏，范建霞，程利南.圍產(chǎn)期B群鏈球菌研究進(jìn)展[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40（2）：137-141.

[3]Verani JR， McGee L， Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease–revised guidelines from CDC， 2010. MMWR Recomm Rep 2010，59：1-36.

作者簡介

鄒霞，女，四川省瀘州市人。研究生。檢驗師。研究方向為分子診斷。