阿侖膦酸鈉干預(yù)膝關(guān)節(jié)炎大鼠Wnt通路及Ⅱ型膠原蛋白的實(shí)驗(yàn)機(jī)制研究

鄧斌　王錫奕　許冬青　康書(shū)鵬　張廣波　莊鑫泓　王曉躍　許鎮(zhèn)文

【摘要】 目的：觀察阿侖膦酸鈉（ALN）對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響，探討ALN治療膝關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。方法：取4周齡SPF級(jí)SD大鼠15只關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)并傳至第3代，將第3代軟骨細(xì)胞平均分為3組：空白對(duì)照組（SD CON）軟骨細(xì)胞用常規(guī)DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d;IL-1β誘導(dǎo)組（SD IL-1β）軟骨細(xì)胞用10 ng/mL重組人IL-1β培養(yǎng)2 d后更換為常規(guī)DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d;

IL-1β+ALN組（SD IL-1β+ALN）軟骨細(xì)胞用10 ng/mL重組人IL-1β培養(yǎng)2 d后更換為濃度為

1×10-6mol/L的ALN培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)后取細(xì)胞進(jìn)行比較觀察，檢測(cè)各組中Collagen Ⅱ、Wnt3a、Wnt5a及Wnt16的變化。結(jié)果：Collagen Ⅱ、Wnt3a、Wnt5a和Wnt16在軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)，經(jīng)ALN處理后軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白增加。Wnt3a在空白對(duì)照組和IL-1β誘導(dǎo)組表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在IL-1β+ALN組中表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Wnt5a在IL-1β誘導(dǎo)組中的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;ALN處理后，表達(dá)量降低，但仍高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Wnt16在IL-1β誘導(dǎo)組中表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;ALN處理后表達(dá)量升高，但仍低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：ALN可能通過(guò)Wnt信號(hào)通路提高Wnt3a、Wnt16的表達(dá)與降低Wnt5a的表達(dá)，間接影響RANKL/RANK/OPG信號(hào)系統(tǒng)，并影響下游MMP-13、β-catenin及Collagen Ⅱ蛋白的表達(dá)來(lái)共同調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，從而保護(hù)軟骨和軟骨下骨。

【關(guān)鍵詞】 阿侖膦酸鈉; Wnt信號(hào)通路; Ⅱ型膠原蛋白; 骨關(guān)節(jié)炎; 大鼠

Research of Mechanism on Affect of Alendronate Sodium on Wnt Signaling Pathway and Collagen Ⅱ in Knee Osteoarthritis Rats/DENG Bin，WANG Xiyi，XU Dongqing，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（21）：0-030

【Abstract】 Objective：To research the effect of Alendronate Sodium（ALN）on chondrocytes induced by IL-1β in vitro in knee osteoarthritis rats and to explore the mechanism of ALN in the treatment of knee osteoarthritis.Method：Fifteen articular chondrocytes of 4-week-old SPF-grade SD rats were cultured and passaged to the third passage.The third generation chondrocytes were divided into three groups：blank control group（SD CON），chondrocytes were cultured in DMEM complete medium for 5 d.IL-1β induction group（SD IL-1β），chondrocytes were cultured with 10 ng/mL recombinant human IL-1β for 2 d and replaced with normal DMEM complete culture medium for 3 d.IL-1β+ALN group（SD IL-1β+ALN），chondrocytes were cultured with 10 ng/mL recombinant human IL-1β for 2 d and replaced with ALN with a concentration of 1×10-6 mol/L for 3 d.The changes of Collagen Ⅱ，Wnt3a，Wnt5a and Wnt16 in each group were detected.Result：The expression of Collagen Ⅱ，Wnt3a，Wnt5a and Wnt16 were found in chondrocytes，the increasing expression of Collagen Ⅱ after ALN treatment.There was no significant difference in the expression of Wnt3a between the blank control group and IL-1β induction group（P>0.05）.The expression of Wnt3a in IL-1β+ALN group was significantly higher（P<0.05）.The expression of Wnt5a in IL-1βinduction group was significantly higher than that in blank control group（P<0.05），after ALN treatment it decreased，but it was still higher than that in the blank control group（P<0.05）.And the expression level of Wnt16 in IL-1βinduction group was significantly lower than that in the blank control group（P<0.05），after ALN treatment it increased，but it was still lower than that of the blank control group（P<0.05）.Conclusion：By Wnt signaling pathway Alendronate Sodium can increase the expression of Wnt3a，Wnt-16 and decrease that of Wnt5a and indirectly affect the RANKL/RANK/OPG signaling pathway and the downstream factor，for example MMP-13，β-catenin and Collagen Ⅱ proteins，co-regulate the dynamic balance of osteoclasts and osteoblasts，protect cartilage and subchondral bone.

【Key words】 Alendronate Sodium; Wnt signaling pathway; Collagen Ⅱ; Osteoarthritis; Rat

First-authors address：Traditional Chinese Medicine Hospital in Puning City，Puning 515300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.21.007

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常見(jiàn)而多發(fā)的慢性關(guān)節(jié)疾病，女性發(fā)病率高于男性[1]，這可能與女性內(nèi)分泌的變化特點(diǎn)和骨質(zhì)疏松有關(guān)。目前我國(guó)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（KOA）的發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)逐步上升，王斌等[2]對(duì)中國(guó)人KOA流行病學(xué)特征進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)KOA的患病率約為18%。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已有不少學(xué)者基于臨床水平研究了治療OA的藥物，但OA發(fā)病原因和機(jī)制目前尚未完全闡明。文獻(xiàn)[3]報(bào)道用阿侖膦酸鈉（ALN）治療OA，可明顯改善膝關(guān)節(jié)炎的病理病變，取得了較好的效果，引起了很多學(xué)者極大的興趣。本研究通過(guò)對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行ALN干預(yù)，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原（Collagen Ⅱ）、Wnt3a、Wnt5a及Wnt16等表達(dá)情況，觀察ALN對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響，探討ALN治療膝關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用ALN治療OA提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)SD大鼠15只，雌雄不限，體重100～150 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，7500），超微量核酸分析儀（Nano-200），PCR儀（北京東林昌盛科技有限公司，DL9700），倒置顯微鏡（OLYMPUS，CKX41）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 ALN（北京萬(wàn)生藥業(yè)公司）;Collagen Ⅱ、多克隆抗體，Trizol（Invitrogen），甲苯胺藍(lán)染色液（G3663），Wnt3a（abcam），Wnt5a（abcam），Wnt16（Santa），重組人IL-1β（abcam），DAB顯色試劑盒（AURAGENE）。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將第3代軟骨細(xì)胞分為3組，空白對(duì)照組（SD CON）：軟骨細(xì)胞用常規(guī)DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d;IL-1β誘導(dǎo)組（SD IL-1β）：軟骨細(xì)胞以10 ng/mL、重組人IL-1β培養(yǎng)2 d后更換為常規(guī)DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d;IL-1β+ALN組（SD IL-1β+ALN）：IL-1β誘導(dǎo)后加ALN培養(yǎng)軟骨細(xì)胞以10 ng/mL重組人IL-1β培養(yǎng)2 d后更換為濃度為1×10-6 mol/L的ALN培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)后取細(xì)胞進(jìn)行以下觀察。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 取4周齡SD大鼠，頸椎脫臼法處死后立即采用75%乙醇浸泡，在無(wú)菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離大腿腿骨，盡可能去除筋膜、肌肉和結(jié)締組織;從關(guān)節(jié)處分離出軟骨組織，剪成小于1 mm3的組織塊，用含有雙抗的PBS沖洗2次，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置入37 ℃的恒溫?fù)u床中，震蕩消化

30 min;4 ℃靜置5 min，棄上清，加入0.2%膠原酶Ⅱ，置于37 ℃的恒溫?fù)u床中，震蕩消化30～60 min;加入培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后通過(guò)200目濾網(wǎng)。收集濾液，1 200 r/min離心8 min，棄上清，用培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液至第5天更換培養(yǎng)液，軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)中，約24 h出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞三角形或多角形，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)3～5 d進(jìn)入快速增殖期。

1.5.2 甲苯胺藍(lán)染色 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，消化后以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于鋪有爬片的24孔板中，每孔最終培養(yǎng)基量為500 ?L，

培養(yǎng)24 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS清洗干凈。每孔加入500 ?L多聚甲醛，固定15 min。吸去孔內(nèi)多聚甲醛，用PBS清洗2次。每孔加入0.1%甲苯胺藍(lán)染色液500 ?L，染色30 min后鏡檢拍照。

1.5.3 免疫組化 固定好的細(xì)胞爬片空氣干燥

5 min，PBS沖洗后，1%Triton X-100（DPBS配制）孵育10 min，PBS沖洗，滴加適當(dāng)稀釋的一抗，空白對(duì)照組滴加等量PBS，37 ℃溫箱放置1.5 h，孵育二抗，將載玻片從冰箱中取出，沖洗后，滴加50～100 μL二抗，37 ℃溫箱孵育30 min將片子從溫箱中取出，沖洗后滴加預(yù)制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，將顯色后的片子蒸餾水洗滌，浸泡于蘇木素中復(fù)染1～3 min，蒸餾水沖洗，95%酒精脫水

3 min，2次，中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察。

1.5.4 qPCR染料法檢測(cè) 采用Trizol法提取各組軟骨細(xì)胞總RNA，RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：上下游引物（10 μmol/L）0.5 ?L，cDNA 1.5 μL，ddH2O

10 μL，SYBR Green I 2×5 μL。PCR反應(yīng)條件：

95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s

40個(gè)循環(huán)檢測(cè)樣本Ct值。以GAPDH為對(duì)照內(nèi)參基因，并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。