東海鼠尾藻巖藻黃質(zhì)含量的高效液相色譜法測(cè)定

高捷 沃聯(lián)群 王銀羽 李成平

[摘要] 目的 建立東海鼠尾藻巖藻黃質(zhì)含量測(cè)定的高效液相色譜法。 方法 選用美國(guó)賽分Welch C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相用乙酸乙酯和90%甲醇水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，波長(zhǎng)為450 nm，柱溫：室溫。 結(jié)果 方法的線性范圍為2.7～43.2 μg/mL（r = 0.9997），檢出限（3S/N）為0.027 μg/mL，定量限（10S/N）為0.086 μg/mL?；厥章试?9.6%～105.0%之間，RSD為1.78%（n = 9）。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便靈敏，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于巖藻黃質(zhì)的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法;巖藻黃質(zhì);鼠尾藻

[中圖分類號(hào)] R917.101? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）07（a）-0039-04

High performance liquid chromatography determination of fucoxanthin content in Sargassum thunbergii of the East China Sea

GAO Jie1? ?WO Lianqun1? ?WANG Yinyu2? ?LI Chengping2，3

1.Zhejiang Pharmaceutical College， Zhejiang Province， Ningbo? ?315100， China; 2.College of Pharmaceutical Science， Zhejiang University of Technology， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310032， China; 3.College of Biology and Environment Engineering， Zhejiang Shuren University， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310015， China

[Abstract] Objective To establish an high performance liquid chromatography method for the determination of fucoxanthin content in Sargassum thunbergii of the East China Sea. Methods The samples （20 L） were separated on a Sepax Welch C18 column （4.6 mm×250.0 mm， 5 μm） with a gradient elution of ethyl acetate and 90% aqueous methanol at a flow rate of 1.0 mL/min and detected at 450 nm. The column temperature was kept at room temperature. Results A good linearity was obtained in the test range of 2.7-43.2 μg/mL （r = 0.9997）. The limit of detection （3S/N） was 0.027 μg/mL and the limit of quantitation （10S/N） was 0.086 μg/mL. The average recoveries of fucoxanthin were between 99.6% and 105.0%， with a RSD of 1.78% （n = 9）. Conclusion The method is simple， sensitive， accurate， and can be used for the quality control of fucoxanthin.

[Key words] High performance liquid chromatography; Fucoxanthin; Sargassum thunbergii

巖藻黃質(zhì)化學(xué)名為3′-（乙酰氧基）-6′，7′-二脫氫-5，6-環(huán)氧-5，5′，6，6′，7，8-六氫-3，5′-二羥基-8-氧代-β，β-胡蘿卜素，分子式：C42H58O6，研究表明巖藻黃質(zhì)具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂及減肥等多種生物活性[1-9]。巖藻黃質(zhì)己成為當(dāng)前海洋藥物探索與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。

現(xiàn)國(guó)內(nèi)與國(guó)外關(guān)于巖藻黃質(zhì)的研究大多取材于海帶、裙帶菜和羊棲菜等[10-14]，以鼠尾藻為材料提取巖藻黃質(zhì)的研究最近才有報(bào)道[15-16]。海帶、裙帶菜等大型藻類生長(zhǎng)速率慢，巖藻黃質(zhì)含量低，需要較長(zhǎng)時(shí)間和相對(duì)高的成本才能獲得足夠提取量。東海富生鼠尾藻[Sargassum thunbergii（Mert.）O′Kuntze]，屬于褐藻門(mén)、圓子綱、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬，富含巖藻黃質(zhì)[15，17-18]。為了配合筆者所在團(tuán)隊(duì)進(jìn)行的“東海鼠尾藻中巖藻黃質(zhì)的提取工藝研究和抗更年期肥胖活性評(píng)價(jià)”項(xiàng)目研究，本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[19-20]建立了東海鼠尾藻中巖藻黃質(zhì)含量測(cè)定的高效液相色譜法。經(jīng)方法學(xué)試驗(yàn)，該方法簡(jiǎn)便靈敏、可行，可用于本品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(tǒng)（P230Ⅱ高壓恒流泵、UV230Ⅱ紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、LU230Ⅱ低壓梯度混合器，大連依利特分析儀器有限公司）;快速溶劑萃取儀（Dionex ASE 200）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-3000，上海亞榮生化儀器廠）;電子天平（AB 204-N，瑞士梅特勒-托利多公司）;高速離心機(jī)（Biofuge Primo R，上?？凭x器公司）等。

甲醇（分析純，天津四友）;乙醇（分析純，天津四友）;甲醇（色譜純，美國(guó)天地）;乙醇（色譜純，美國(guó)天地）;乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)天地）;鼠尾藻試驗(yàn)樣品（產(chǎn)地：溫州）;巖藻黃質(zhì)對(duì)照品（BOC Sciences批號(hào)：20131010）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜分離柱：C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），美國(guó)賽分Welch;流動(dòng)相A：水-甲醇（1∶9，V/V）;流動(dòng)相B：乙酸乙酯;線性梯度洗脫：B在20 min內(nèi)由0增至100%;流速1.0 mL/min;柱溫：室溫;波長(zhǎng)450 nm，進(jìn)樣量20 μL。在該色譜條件下，樣品及對(duì)照色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性關(guān)系

精密稱取巖藻黃質(zhì)對(duì)照品10.8 mg，于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.08 mg/mL巖藻黃質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4℃下避光低溫貯存。

精密吸取一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液并用流動(dòng)相逐步稀釋至2.7、5.4、10.8、21.6、43.2 μg/mL的對(duì)照品系列工作液，按“2.1”色譜條件，分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)對(duì)溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A = 78.167C + 106.94，R = 0.9997。說(shuō)明巖藻黃質(zhì)在2.7～43.2 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。檢出限（3S/N）為0.027 μg/mL，定量限（10S/N）為0.086 μg/mL。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液（10.8 μg/mL），按“2.1”色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定巖藻黃質(zhì)峰面積，分別為954.47、965.13、945.30、952.54、957.73;計(jì)算得RSD為0.76%，表明儀器性能良好，該方法精密度較高。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一批鼠尾藻6份，每份5 g，制成樣品溶液，分別依次按“2.1”色譜條件測(cè)定。測(cè)得巖藻黃質(zhì)的峰面積，得出鼠尾藻樣品中巖藻黃質(zhì)提取率分別為6.764、6.794、6.808、6.736、7.108、6.972 μg/g，計(jì)算得RSD為2.11%，表明該方法提取重現(xiàn)性良好。

2.5 加樣回收率

按“2.1”色譜條件，精密稱取已測(cè)知含量的巖藻黃質(zhì)樣品共9份，各置于100 mL容量瓶中，加該樣品量的80%、100%、120%的巖藻黃質(zhì)對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解后稀釋到刻度，進(jìn)樣20 μL，依法測(cè)定，分別記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 樣品含量測(cè)定

取一定量的鼠尾藻，洗凈、干燥、粉碎后，過(guò)60目篩，放在-20℃冰箱里避光備用。精確稱取一定量的鼠尾藻粉末置于燒杯中，加入95%乙醇，搖勻，封口，置于60℃的超聲波清洗器中，超聲提取30 min，取出，放置室溫下冷卻。將提取液過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40℃的條件下旋蒸濃縮至10 mL。取樣1 mL置于離心管中，在高速離心機(jī)中離心5 min，取上清液，過(guò)0.45 μm膜的濾液作樣品溶液。另取巖藻黃質(zhì)對(duì)照品，加流動(dòng)相制成10.8 μg/mL的溶液作對(duì)照溶液，按“2.1”色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，按外標(biāo)法計(jì)算巖藻黃質(zhì)提取率為3.72 μg/g。

2.7 分離專屬性

吸取43.2 μg/mL的巖藻黃質(zhì)1 mL，共5份，分別經(jīng)100℃加熱3 h，0.1 mol/L酸或堿、3%過(guò)氧化氫60℃恒溫處理2 h，陽(yáng)光直射0.5 h。取樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)對(duì)酸、堿、氧化劑、高溫及光照均不穩(wěn)定，尤其酸呈現(xiàn)100%的破壞率。在“2.1”色譜條件下，巖藻黃質(zhì)峰與酸、堿、高溫、氧化及光照降解產(chǎn)物均能很好地分離（圖2）。

3 討論

3.1 液相色譜梯度洗脫的優(yōu)點(diǎn)

在巖藻黃質(zhì)提取工藝研究中，巖藻黃質(zhì)含量測(cè)定較多采用分光光度法[12-14，16]。而海帶等海藻類是自養(yǎng)生物，除了含有巖藻黃質(zhì)之外，還具有維持光合作用所必需的葉綠素等。葉綠素在400～500 nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)吸收。使用有機(jī)試劑萃取時(shí)，巖藻黃質(zhì)將與葉綠素一并萃取出來(lái)。用分光光度法測(cè)定時(shí)，葉綠素對(duì)巖藻黃質(zhì)的分析產(chǎn)生干擾[19]。

巖藻黃質(zhì)含量測(cè)定的高效液相色譜法較多采用流動(dòng)相等度洗脫[15，20]，本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]改進(jìn)，對(duì)流動(dòng)相所用的比例進(jìn)行系列試驗(yàn)，結(jié)果表明加入乙酸乙酯，選用梯度洗脫，巖藻黃質(zhì)的峰形得到較大改善，峰高變高，半峰寬減小，峰形較為對(duì)稱，水-甲醇=10∶90時(shí)峰形為最佳。相對(duì)于參考文獻(xiàn)[19]采用乙腈/水流動(dòng)相更經(jīng)濟(jì)和環(huán)保。

3.2 不同條件對(duì)巖藻黃質(zhì)的影響

本研究在對(duì)巖藻黃質(zhì)的破壞性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，巖藻黃質(zhì)其實(shí)很不穩(wěn)定，非常容易分解，且對(duì)酸、堿、氧化劑、高溫及光照均不穩(wěn)定，其貯存條件對(duì)環(huán)境的要求很苛刻，在實(shí)驗(yàn)中要注意避光和低溫操作。

實(shí)驗(yàn)表明，用高效液相色譜法對(duì)東海鼠尾藻中的巖藻黃質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，快速、簡(jiǎn)便、靈敏，重現(xiàn)性好，可用于鼠尾藻中巖藻黃質(zhì)含量的質(zhì)量控制。

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