肺炎支原體實(shí)時(shí)熒光定量DNA檢測(cè)的臨床研究

肖宗浩

【摘要】 目的：分析肺炎支原體實(shí)時(shí)熒光定量DNA檢測(cè)的臨床研究。方法：將2017年8月-2018年2月本院收治的98例呼吸道感染患兒作為此次研究檢測(cè)對(duì)象，均行MP-DNA和肺炎支原體血清學(xué)抗體檢測(cè)，觀察兩種檢測(cè)方法的最終陽(yáng)性檢出率與不同時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)情況，并觀察兩組患兒癥狀緩解時(shí)間、重癥病例發(fā)生情況、肺外并發(fā)癥、后遺癥、住院天數(shù)等情況。結(jié)果：本組98例呼吸道感染患兒中確診為MP感染者共36例，占比36.73%，其中MP-DNA陽(yáng)性檢出35例，MP-IgM陽(yáng)性檢出33例，兩種方法最終MP感染檢出率對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在所有MP感染患兒中，入院當(dāng)日確診為MP感染者共29例，入院后1周確診者33例，入院后2周確診者36例，MP-DNA檢測(cè)在入院當(dāng)日陽(yáng)性檢出率明顯高于MP-IgM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)不同方法檢測(cè)后并接受一段時(shí)間治療顯示MP-DNA檢測(cè)者癥狀緩解時(shí)間及住院天數(shù)均短于MP-IgM檢測(cè)，且MP-DNA檢測(cè)并接受治療者重癥病例、肺外并發(fā)癥及后遺癥發(fā)生率均少于MP-IgM者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光定量DNA檢測(cè)對(duì)MP感染的早期診斷具有積極的意義，在臨床上可以早期干預(yù)，對(duì)預(yù)防重癥病例的發(fā)生及減少因MP感染引起的并發(fā)癥及后遺癥。

【關(guān)鍵詞】 呼吸道感染; 肺炎支原體; 感染; 血清學(xué)抗體; 實(shí)時(shí)熒光定量DNA

Clinical Study of MP-DNA Detection with Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction/XIAO Zonghao.//Medical Innovation of China，2019，16（06）：0-053

【Abstract】 Objective：To study the mycoplasma pneumoniae- deoxyribose nucleic acid（MP-DNA）detection with real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time quantitative PCR）.Method：A total of 98 respiratory tract infection children treated in our hospital from August 2017 to February 2018 were selected.Children were tested by MP-DNA and MP-IgM.The positive detection rate and detection conditions at each time period as well as symptom relief time，incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela and hospitalization days were estimated.Result：36 cases（36.73%）were proved as MP infection，the positive detection cases based on MP-DNA and MP-IgM were 35 cases and 33 cases，the MP infection rate based on two methods was not statistically different（P>0.05）.Among MP infection children，29 MP infection cases were proved upon admission to hospital，33 cases after 1 week of admission and 36 cases after 2 weeks of admission.Upon admission to hospital，the positive detection rate based on MP-DNA was statistically higher than that of

MP-IgM（P<0.05）.After treatment，the symptom relief time and hospitalization days based on MP-DNA were shorter than those of MP-IgM，the incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela based on MP-DNA were statistically lower than those of MP-IgM（P<0.05）.Conclusion：The real-time quantitative PCR is of great importance to the early diagnosis of MP infection，can reduce the incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela.

【Key words】 Respiratory tract infection; Mycoplasma pneumoniae; Infection; Serological antibody;Real-time quantitative PCR

First-authors address：Meizhou Maternal and Child Health Family Planning Service Center，Meizhou 514000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.06.013

肺炎支原體（MP）可引起人類上呼吸道和下呼吸道感染，亦是引起兒童呼吸系統(tǒng)感染的重要病原之一，MP屬于柔膜體綱原核生物，缺乏細(xì)胞壁，對(duì)細(xì)菌性肺炎治療中常用的靶點(diǎn)為細(xì)胞壁的抗生素（如青霉素、頭孢類等）無(wú)效[1]。除了引起兒童、成人呼吸系統(tǒng)感染外，許多研究表明肺炎支原體還與許多其他肺外病變有關(guān)[2]。MP感染后治療不及時(shí)、不徹底容易引起反復(fù)呼吸道感染和嚴(yán)重的并發(fā)癥，因此早期診斷尤為重要，可避免臨床上用藥不當(dāng)而延誤病情或產(chǎn)生耐藥菌[3]。以往多采用MP培養(yǎng)和分離，但由于MP生長(zhǎng)緩慢，一般培養(yǎng)法不能滿足臨床快速診斷的需求，熒光定量DNA檢測(cè)是目前國(guó)內(nèi)外最常用的MP感染診斷方法，其具有高度的敏感性和特異性，在MP感染的早期診斷中起到非常重要的作用[4-5]。

此次研究對(duì)2017年8月-2018年2月本院兒科住院的98例呼吸道感染患兒進(jìn)行MP實(shí)時(shí)熒光定量DNA檢測(cè)和MP血清學(xué)抗體檢測(cè)，觀察不同檢測(cè)方法的檢出情況及患兒預(yù)后治療情況?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 此次研究案例資料均來(lái)源于2017年8月-2018年2月本院兒科收治的呼吸道感染的患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)明顯的呼吸道感染癥狀;入選前未接受抗生素治療者;均為起病1周以內(nèi)就醫(yī)的患兒;對(duì)所有受試者采取的醫(yī)療措施均取得受試者家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肺部疾病或心肝腎等臟器功能不全者;精神或認(rèn)知功能障礙，無(wú)法配合檢測(cè)治療者。最終98例患兒納入研究，其中男56例和女42例，年齡3個(gè)月～12歲，平均（5.51±2.50）歲，年齡分布：3個(gè)月～4歲52例，4～8歲26例，8歲以上20例。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法 所有患者分別在入院當(dāng)日、入院后1周及入院后2周抽取血標(biāo)本常規(guī)送檢，用微型顆粒凝集法（日本富士Serodla-macoⅡ顆粒凝集試劑盒）檢測(cè)血清MP-IgM抗體，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。同時(shí)分別在這三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)定量取0.20 mL血清，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（由TaKaRa公司提供）提供的以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR：總體積25 μL（含有12.5 μL的1×SYBR Premix DimerEraser，0.2 μmol的特異引物，2 μL cDNA模板）。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s一個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s和60 ℃ 31 s 40個(gè)循環(huán)。根據(jù)檢測(cè)已知濃度的倍比稀釋的純化肺炎支原DNA的PCR產(chǎn)物做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)肺炎支原體DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。

1.2.2 治療方法 當(dāng)MP-DNA檢測(cè)，將拷貝數(shù)≥1×103 copy/mL的陽(yáng)性患兒考慮為MP感染;

MP-IgM檢測(cè)，將MP-IgM≥1︰160的陽(yáng)性患兒考慮為MP感染。明確診斷后給予抗支原體治療，首先進(jìn)行呼吸道隔離，休息，供給足量水分及營(yíng)養(yǎng)。積極化痰止咳，及時(shí)清除鼻內(nèi)分泌物，保持呼吸道通暢，必要時(shí)可霧化吸入。選用具有緩慢而持久作用的解熱鎮(zhèn)痛藥，如乙酰氨基酚。關(guān)于該病的抗菌治療：（1）臨床首選阿奇霉素，用量為10 mg/（kg·d），5 d為一療程。根據(jù)情況可以應(yīng)用2～4個(gè)療程，甚至更長(zhǎng)。阿奇霉素每日僅需1次用藥，使用天數(shù)較少，已成為治療首選[2]。但對(duì)于6個(gè)月以下的嬰兒，阿奇霉素的使用尤其是靜脈制劑的使用要慎重，最好使用口服阿奇霉素制劑[3]。（2）支原體肺炎至少住院正規(guī)治療2周后改為口服藥物治療，否則療程過(guò)短容易反復(fù)。目前治療肺炎支原體肺炎的主導(dǎo)藥物為新大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素、克拉霉素）、四環(huán)素類（多西環(huán)素、米諾環(huán)素）和喹諾酮類（環(huán)丙沙星、氧氟沙星、莫西沙星）藥物?？垢腥局委煹寞煶掏ǔＰ枰掷m(xù)10～14 d，部分難治性病例的療程可延長(zhǎng)至3周左右，但不宜將肺部陰影完全吸收作為停用抗菌藥物的指征。（3）在上述三類抗菌藥物中，氟喹諾酮類藥物一般情況下應(yīng)避免用于18歲以下的未成年人;四環(huán)素類藥物可引起牙齒黃染及牙釉質(zhì)發(fā)育不良，8歲以下的兒童亦不宜使用。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩種檢測(cè)方法最終MP陽(yáng)性檢出率與不同時(shí)間點(diǎn)MP感染的檢測(cè)情況，即入院當(dāng)日、入院后1周、入院后2周進(jìn)行觀察，并觀察兩組患兒癥狀緩解時(shí)間、住院天數(shù)、重癥病例發(fā)生情況、肺外并發(fā)癥、后遺癥情況。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn) 以雙份血清抗體低度呈4倍以上增長(zhǎng)作為確診MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)，并聯(lián)合臨床癥狀、胸片等，參照諸福棠《實(shí)用兒科學(xué)》第7版中難治性肺炎支原體肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法最終檢出MP感染情況 本組98例呼吸道感染患兒中確診為MP感染者共36例，占比36.73%，其中MP-DNA陽(yáng)性檢出35例，MP-IgM陽(yáng)性檢出33例，兩種方法最終MP感染檢出率對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)MP感染檢測(cè)情況比較 本組98例患兒，入院當(dāng)日確診為MP感染者共29例，入院后1周確診者32例，入院后2周確診者35例，MP-DNA檢測(cè)在入院當(dāng)日陽(yáng)性檢出率明顯高于MP-IgM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 兩種檢測(cè)方法治療后癥狀緩解時(shí)間、住院天數(shù)比較 經(jīng)不同方法檢測(cè)后，兩組患兒接受一段時(shí)間治療顯示，MP-DNA檢測(cè)者癥狀緩解時(shí)間及住院天數(shù)均短于MP-IgM檢測(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

2.4 兩種檢測(cè)方法治療者重癥病例、肺外并發(fā)癥以及后遺癥發(fā)生情況比較 MP-DNA檢測(cè)并接受治療者重癥病例、肺外并發(fā)癥以及后遺癥的發(fā)生率均少于MP-IgM者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

MP是兒童社區(qū)獲得性肺炎（CAP）的重要病原之一，肺炎支原體肺炎（MPP）占住院兒童CAP的10%～40%，是兒科醫(yī)師廣泛關(guān)注的臨床問(wèn)題[6]。MP感染的臨床表現(xiàn)多種多樣，感染既可以發(fā)生在上、下呼吸道及肺臟，亦可累及肺外系統(tǒng)，MP感染的臨床癥狀不具有特征性，其疾病的嚴(yán)重程度可變度大，可能會(huì)危及生命或?qū)е聡?yán)重的后遺癥[7-8]。近年來(lái)，兒童MPP呈現(xiàn)不少新的特點(diǎn)，臨床上不斷有肺炎支原體的報(bào)道，使用了“重癥肺炎支原體肺炎（SMPP）”“難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）”“大環(huán)內(nèi)酯類耐藥肺炎支原體肺炎（MRMPP）”等名稱，顯然MP感染給臨床帶來(lái)了新的問(wèn)題和難點(diǎn)，更帶來(lái)診治上的挑戰(zhàn)[9-10]。因此，對(duì)MP感染的早期診斷顯得尤為重要，早期干預(yù)對(duì)預(yù)防重癥及減少并發(fā)癥的發(fā)生起到積極的作用[11]。

目前臨床上MP的病原學(xué)檢測(cè)：MP的培養(yǎng)和分離、MP核酸擴(kuò)增技術(shù)、MP血清學(xué)檢測(cè)。其中經(jīng)典的MP培養(yǎng)和分離是對(duì)咽拭子、氣道吸出物、胸腔穿刺液和肺泡灌洗液進(jìn)行MP的分離培養(yǎng)，是診斷最可靠的依據(jù)[12]。但MP培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢，因而缺乏早期診斷價(jià)值。MP血清學(xué)檢測(cè)是目前臨床診斷MP感染的主要手段[13]。血清學(xué)檢測(cè)主要檢測(cè)MP-IgM、MP-IgG。單次MP-IgM抗體滴度≥1︰160對(duì)MP近期感染或急性感染有診斷價(jià)值，恢復(fù)期和急性期MP-IgM或IgG抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時(shí)，亦可診斷為MP感染[14]。但血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果受病程的影響，即使早期產(chǎn)生的IgM也需要在感染1周后才能被檢測(cè)到[15]。嬰幼兒由于免疫功能尚未發(fā)育完善、產(chǎn)生抗體的能力較低，可能出現(xiàn)假陰性或低滴度的抗體[16]。2009-2012年北京兒童醫(yī)院對(duì)呼吸道感染兒童使用MP實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)病原進(jìn)行流行病學(xué)的統(tǒng)計(jì)[17]，近年分子檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于MP診斷領(lǐng)域，包括普通PCR、巢式PCR、RT-PCR等，其可快速檢測(cè)到體內(nèi)微量MP-DNA，方法的敏感度、特異度好，且不受患者免疫功能的影響[18]。楊文青等[19]對(duì)742例兒科住院患兒收集標(biāo)本進(jìn)行MP-DNA的定量檢測(cè)得出，4歲及以上兒童易感染肺炎支原體，且隨著年齡增長(zhǎng)感染率逐漸增高;支氣管灌洗液標(biāo)本的MP-DNA陽(yáng)性率較高;FQ-PCR法檢測(cè)MP-DNA用于肺炎支原體感染的診斷有一定價(jià)值;林超群等[20]亦在研究中說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)肺炎支原體感染的診斷與治療后監(jiān)測(cè)比肺炎支原體抗體血清學(xué)檢測(cè)更優(yōu)。為進(jìn)一步盡早精準(zhǔn)診斷，及時(shí)給予精準(zhǔn)治療，對(duì)本院98例呼吸道感染患兒分別行MP-DNA和肺炎支原體血清學(xué)抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示：MP-DNA與MP-IgM兩種方法在MP感染陽(yáng)性檢出率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但MP-DNA檢測(cè)在患兒入院當(dāng)日MP感染陽(yáng)性檢出率明顯高于MP-IgM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)不同方法檢測(cè)后并接受一段時(shí)間治療顯示Mp-DNA檢測(cè)者癥狀緩解時(shí)間及住院天數(shù)均短于MP-IgM檢測(cè)，且Mp-DNA檢測(cè)并接受治療者重癥病例、肺外并發(fā)癥以及后遺癥的發(fā)生率均少于MP-IgM者（P<0.05）。可見(jiàn)實(shí)時(shí)熒光定量能檢測(cè)出病原體的DNA和RNA，能反映MP在人體內(nèi)的生存情況，其不受年齡、產(chǎn)生抗體的能力、病程長(zhǎng)短及用藥等因素的影響，在MP感染早期的檢出率最高。

然而關(guān)于肺炎支原體如何進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)制目前尚未完全明確，以下幾點(diǎn)是本研究尚未解決而需作進(jìn)一步研究的：（1）相同的肺炎支原體感染患者中同時(shí)檢測(cè)痰液、咽拭子與血清中的肺炎支原體DNA定量，比較其檢測(cè)率的差異;（2）比較血清與全血中肺炎支原體DNA定量的差異;（3）擴(kuò)大樣本含量，進(jìn)行肺炎支原體抗體與肺炎支原體DNA定量在各個(gè)病程階段的對(duì)比研究。綜上所述，MP感染可損傷全身任何系統(tǒng)，也說(shuō)明其疾病的嚴(yán)重程度可變度大，可能危及生命或?qū)е聡?yán)重的后遺癥。因此早期診斷、早期治療顯得尤為重要，實(shí)時(shí)熒光定量MP-DNA在MP感染早期的檢出率最高，檢測(cè)時(shí)間短，敏感度及特異度高。早期精準(zhǔn)診斷，早期治療，避免了濫用或遲用抗生素給患兒帶來(lái)的危害，對(duì)減少M(fèi)PP重癥病例、并發(fā)癥及后遺癥的發(fā)生及縮短住院時(shí)間等有一定的現(xiàn)實(shí)意義，有利于在全市、全省甚至全國(guó)基層醫(yī)院推廣，具有很好的應(yīng)用前景。

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