siRNA-P300鞘內(nèi)注射對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型HIF-1α/VEGF和ERK通路的影響

劉志軍 彭從斌

[摘要] 目的 探討神經(jīng)鞘內(nèi)注射P300小分子干擾RNA（siRNA-P300）對(duì)神經(jīng)病理性疼痛（NP）大鼠模型低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路的影響。 方法 32只鞘內(nèi)置管成功的雄性SD大鼠，隨機(jī)平均分為假手術(shù)組、模型組、陰性對(duì)照組（加入陰性對(duì)照質(zhì)粒）、siRNA-P300組（加入siRNA-P300），每組各8只。坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷法（CCI）構(gòu)建NP大鼠模型。于術(shù)前1 d及術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、14 d檢測(cè)各組大鼠機(jī)械痛閾與熱痛閾;qRT-PCR檢測(cè)P300 mRNA水平;Western blot檢測(cè)P300、Ac-H3、HIF-1α、VEGF及ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá);ELISA法檢測(cè)脊髓液中疼痛介質(zhì)及神經(jīng)炎性因子水平。 結(jié)果 與術(shù)前相比，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠機(jī)械痛閾、熱痛閾降低（P<0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組、陰性對(duì)照組、siRNA-P300組大鼠IL-4及IL-10水平顯著降低（P<0.05），P300 mRNA和蛋白、Ac-H3蛋白、疼痛介質(zhì)5-HT、SP、GABA、炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平、HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，siRNA-P300組大鼠IL-4及IL-10水平顯著升高（P<0.05），P300 mRNA和蛋白、Ac-H3蛋白、疼痛介質(zhì)5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平、HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白水平顯著降低（P<0.05）。 結(jié)論 鞘內(nèi)注射siRNA-P300可能通過抑制HIF-1α/VEGF和ERK通路減輕NP大鼠神經(jīng)病理性疼痛。

[關(guān)鍵詞] P300;siRNA;神經(jīng)鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染;神經(jīng)病理性疼痛

[中圖分類號(hào)] R363.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）20-0037-06

Effect of intrathecal injection of siRNA-P300 on HIF-1α/VEGF and ERK pathways in the rat model of neuropathic pain

LIU Zhijun? ?PENG Congbin

Department of Anesthesiology， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou? ?310012， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of intrathecal injection of P300 small interfering RNA （siRNA-P300） on the hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α）/vascular endothelial growth factor （VEGF） and extracellular signal-regulated kinase （ERK） pathways in the rat model of neuropathic pain （NP）. Methods 32 male SD rats with successful intrathecal intubation were randomly divided into sham operation group， model group， negative control group（given negative control plasmid） and siRNA-P300 group（given siRNA-P300） 8 rats in each group. The NP rat model was constructed by the chronic compression injury（CCI） of the sciatic nerve. The mechanical pain threshold and thermal pain threshold of rats in each group were detected 1 day before operation and 1 day， 3 days， 5 days， 7 days， 9 days and 14 days after operation; qRT-PCR was used to detect P300 mRNA levels; Western blot was used to detect the expression of P300， Ac-H3， HIF-1α， VEGF and ERK pathway-related proteins; the level of pain mediators and neuroinflammatory factors in spinal fluid was measured by ELISA. Results There was no statistically significant difference in mechanical pain threshold and thermal pain threshold in NP rats between sham operation group before operation and 1 day to 14 days after operation（P>0.05）. Compared with the model group， the negative control group and the siRNA-P300 group before operation， the mechanical pain threshold and thermal pain threshold of the NP rats in each group were significantly decreased at different time points（P<0.05）. Compared with the sham operation group， the IL-4 and IL-10 levels in the model group， negative control group and siRNA-P300 group were significantly lower（P<0.05）. P300 mRNA and protein， Ac-H3 protein， pain mediators of 5-HT， SP， GABA， inflammatory factors of IFN-γ， TNF-α， IL-1β levels，HIF-1α，VEGF，p-ERK， p-CREB and BDNF protein levels were significantly increased（P<0.05）. Compared with the model group， IL-4 and IL-10 levels were significantly increased in the siRNA-P300 group（P<0.05）. P300 mRNA and protein， Ac-H3 protein， pain mediators of 5-HT， SP， GABA and inflammatory factors of IFN-γ，TNF-α，IL-1β levels， HIF-1α， VEGF， p-ERK， p-CREB and BDNF protein levels were significantly reduced（P<0.05）. Conclusion Intrathecal injection of siRNA-P300 may attenuate neuropathic pain in NP rats by inhibiting HIF-1α/VEGF and ERK pathways.

[Key words] P300; siRNA; Intrathecal transfection; Neuropathic pain （NP）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）主要是指神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損害及其功能障礙引發(fā)的一種慢性疼痛疾病，其主要臨床特征為痛覺過敏、感覺異常、自發(fā)性疼痛等[1]。NP發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，既往研究顯示NP發(fā)病機(jī)制涉及生物化學(xué)、解剖學(xué)、分子生物及電生理基礎(chǔ)等方面[2]。研究表明P300蛋白作為組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶家族一員可通過調(diào)控疼痛介質(zhì)及神經(jīng)炎癥反應(yīng)等表達(dá)進(jìn)而參與神經(jīng)疼痛發(fā)生及發(fā)展過程[3]。故而P300蛋白是否可作為NP治療靶點(diǎn)成為熱點(diǎn)研究。研究表明細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signa1 regulated kinase，ERK）信號(hào)通路活化與NP發(fā)生有關(guān)，甘丙肽受體-1可通過抑制ERK通路激活進(jìn)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[4]。ERK還可調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路，研究發(fā)現(xiàn)通過抑制ERK表達(dá)可抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管生成[5]。關(guān)于HIF-1α/VEGF、ERK信號(hào)通路與NP發(fā)生及發(fā)展的研究相對(duì)較少，因此本研究采用鞘內(nèi)注射P300小分子干擾RNA（siRNA-P300）并分析其對(duì)NP大鼠模型的鎮(zhèn)痛效果，探究其對(duì)HIF-1α/VEGF、ERK信號(hào)通路的影響，為探尋NP治療方案提供可能治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，體重為200～230 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0012。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器? 脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司（批號(hào)：20171203）;siRNA-P300購(gòu)自上海吉瑪公司;Trizol（批號(hào)：2017 1003）、反轉(zhuǎn)錄（批號(hào)：20171105）及SYBRTM GreenERTM Kit試劑盒（批號(hào)：20171014）均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠P300（批號(hào)：2026035）、Ac-H3多克隆抗體（批號(hào)：2026021）均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;兔抗鼠HIF-1α單克隆抗體（批號(hào)：2022056）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;兔抗鼠VEGF多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（批號(hào)：GR51277）;ERK（批號(hào)：12607）及其磷酸化p-ERK（批號(hào)：12608）、轉(zhuǎn)錄環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）（批號(hào)：12713）及其磷酸化p-CREB（批號(hào)12715）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）（批號(hào)：12806）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)：102063）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;人5羥色胺（5-HT）（批號(hào)：20170613）、SP（批號(hào)：20170621）、A型γ-氨基丁酸（GABA）（批號(hào)：20170615）、γ-干擾素（IFN-γ）（批號(hào)：20170618）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號(hào)：20170622）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（批號(hào)：20170701）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）（批號(hào)：20170712）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）（批號(hào)：20160608）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ELISA）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;蛋白裂解液與BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。CFX96Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司;iBright 智能凝膠成像分析系統(tǒng)及Quantity One分析軟件均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;Electronic von Frey Anesthesiometer型電子Von Frey測(cè)痛儀購(gòu)自自然基因科技有限公司;7370熱痛儀購(gòu)自意大利UGO公司;Du-640紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

1.2.2 NP模型建立及分組? 麻醉大鼠并將其仰臥固定，采用腰段鞘內(nèi)置管法進(jìn)行鞘內(nèi)置管，其具體操作參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，術(shù)后導(dǎo)管外口被封閉的硬膜外導(dǎo)管罩住以防止腦脊液外漏，并觀察術(shù)后大鼠活動(dòng)情況并對(duì)導(dǎo)管置入位置進(jìn)行評(píng)價(jià)，所有大鼠均使用青霉素進(jìn)行抗感染且均單獨(dú)飼養(yǎng)。選取鞘內(nèi)置管成功的大鼠32只，隨機(jī)選取8只大鼠作為假手術(shù)組，其余大鼠建立NP模型，采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷法（chronic constriction jinury，CCI）構(gòu)建NP大鼠模型，術(shù)后NP大鼠痛閾明顯升高提示造模成功[7]。將造模成功的大鼠分為模型組、陰性對(duì)照組、siRNA-P300組，每組各8只。陰性對(duì)照組：配置20 μL陰性轉(zhuǎn)染試劑（4 μg siRNA-NC陰性質(zhì)粒溶于20 μL Lipofectamine），術(shù)后3 d時(shí)鞘內(nèi)注射劑量為每天2次，每次10 μL;siRNA-P300組：配置20 μL siRNA-P300（4 μg siRNA-P300轉(zhuǎn)染試劑溶于20 μL Lipofectamine），術(shù)后3 d時(shí)鞘內(nèi)注射劑量為每天2次，每次10 μL;模型組與假手術(shù)組大鼠每天注射等量生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。

1.2.3 監(jiān)測(cè)機(jī)械痛閾與熱痛閾? 分別于術(shù)前1 d及術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、14 d檢測(cè)各組大鼠機(jī)械痛閾與熱痛閾，機(jī)械痛閾檢測(cè)方法：將透明塑料鼠籠作為測(cè)試地，分別將各組大鼠置于測(cè)試圈內(nèi)，30 min后校正Von Frey測(cè)痛儀零點(diǎn)并采用探針刺激大鼠后爪腳掌，此時(shí)大鼠縮爪時(shí)測(cè)痛儀顯示的壓力值即為機(jī)械痛閾值。熱痛閾檢測(cè)方法：分別將各組大鼠置于玻璃板上（厚度約3 mm）并采用透明塑料籠罩住，30 min后采用紅外光源照射大鼠足底并計(jì)時(shí)，大鼠感到疼痛自覺將后足抬起時(shí)停止計(jì)時(shí)，紅外光源照射前后時(shí)間差值即為熱痛閾。機(jī)械痛閾與熱痛閾檢測(cè)均重復(fù)3次并求取平均值。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)P300 mRNA表達(dá)水平? 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)14 d后處死大鼠并采集各組大鼠腰段脊髓并置于-80℃超低溫冰箱保存待測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)P300 mRNA表達(dá)水平，取凍存脊髓，液氮中研磨，加入10 μL Trizol試劑提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，qRT-PCR反應(yīng)體系共20μL：SYBR Green Mstermix 10 μL，cDNA樣本1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。P300上游引物5'-GCCAAGTATGCCAACCCTAA-3'，下游引物5'-TGTTCATTTGCTGAGCTTGG-3';GAPDH上游引物-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物5'-GGTGGTGAAGACGCCAGTAG-3'。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算P300 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 檢測(cè)NP大鼠脊髓液中疼痛介質(zhì)及神經(jīng)炎性因子水平? 轉(zhuǎn)染后14 d時(shí)處死大鼠并分離第5腰椎對(duì)應(yīng)的脊髓組織，加入0.3 mL蛋白裂解液并在冰上充分研磨，3000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離上清液并采用ELISA法檢測(cè)5-HT、SP、GABA、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，同時(shí)采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白含量，計(jì)算每毫克總蛋白中各指標(biāo)含量。

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)P300、Ac-H3、HIF-1α/VEGF及ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)? 取凍存大鼠脊髓，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)大鼠脊髓中P300、Ac-H3、HIF-1α、VEGF、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)。根據(jù)蛋白濃度加入SDS樣本緩沖液，加入蛋白裂解液將各樣本配制終濃度為100 mg/mL的溶液，取10 μL蛋白樣品點(diǎn)入15% SDS-PAGE上并分離不同分子量蛋白，采用預(yù)冷轉(zhuǎn)移緩沖液將蛋白移至PDVF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，TBST洗膜，加入一抗，稀釋比均為1：200，放入4℃冰箱保存過夜，次日采用TBST洗膜，加入二抗（1：5000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，采用ECL液顯色并曝光顯影，置于凝膠分析儀并采用圖像合理性軟件分析各蛋白條帶。以GADPH為內(nèi)參，各目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GADPH的比值表示各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA-P300鞘內(nèi)注射對(duì)NP大鼠機(jī)械痛閾的影響

與術(shù)前比較，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組NP大鼠機(jī)械痛閾均顯著降低（P<0.05）;與假手術(shù)組比較，模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組術(shù)后NP大鼠機(jī)械痛閾均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，siRNA-P300組術(shù)后5 d、7 d、9 d、11 d NP大鼠機(jī)械痛閾顯著升高（P<0.05），模型組與陰性對(duì)照組比較差異不顯著（P>0.05）。見表1。

2.2 siRNA-P300鞘內(nèi)注射對(duì)NP大鼠熱痛閾的影響

與術(shù)前比較，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組NP大鼠熱痛閾均顯著降低（P<0.05）;與假手術(shù)組比較，模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)NP大鼠熱痛閾均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組和陰性對(duì)照組比較，siRNA-P300組術(shù)后5 d、7 d、9 d、14 d時(shí)NP大鼠熱痛閾顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型組與陰性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組NP大鼠P300、Ac-H3蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組NP大鼠P300 mRNA蛋白及Ac-H3蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組及陰性對(duì)照組比較，siRNA-P300組NP大鼠P300 mRNA蛋白及Ac-H3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型組與陰性對(duì)照組比較，差異不顯著（P>0.05）。見圖1、表3。

2.4 siRNA-P300鞘內(nèi)注射對(duì)NP大鼠神經(jīng)疼痛及炎癥反應(yīng)程度的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中疼痛介質(zhì)5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P<0.05），IL-4與IL-10水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組及陰性對(duì)照組相比，siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05），IL-4與IL-10水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;模型組與陰性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4、表5。

2.5 siRNA-P300鞘內(nèi)注射對(duì)NP大鼠HIF-1α/VEGF、ERK通路的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組NP大鼠HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），ERK與CREB蛋白表達(dá)水平比較差異不顯著（P>0.05）;與模型組及陰性對(duì)照組相比，siRNA-P300組NP大鼠HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），ERK與CREB蛋白表達(dá)水平比較，差異差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且模型組與陰性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2、表6。

3 討論

目前關(guān)于NP確切發(fā)病機(jī)制及其具體發(fā)生過程均尚未完全闡明，臨床尚缺乏有效治療手段，因而探究NP發(fā)生機(jī)制及有效治療方法成為研究熱點(diǎn)[8]。既往研究表明物理性機(jī)械損傷、病毒感染、缺血性神經(jīng)損害等均可引發(fā)NP[9]。為了進(jìn)一步研究NP發(fā)病機(jī)制建立各種動(dòng)物NP模型，研究表明CCI、坐骨神經(jīng)分支選擇損傷模型（SNI）、脊神經(jīng)選擇結(jié)扎模型（SNL）等均為常用NP模型，其中CCI模型主要特征為外周及中樞敏化，并可采用機(jī)械痛閾、熱痛閾檢測(cè)疼痛行為，且具有操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷性小等優(yōu)點(diǎn)[10]。因此，本研究通過構(gòu)建CCI模型進(jìn)一步探究NP有效治療方法及其可能作用機(jī)制，為提高NP治療效果提供一定理論依據(jù)。

P300屬于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶且具有輔助激活因子作用，組蛋白去乙?；缚蓪?duì)NP發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，進(jìn)一步研究顯示大鼠脊髓中P300表達(dá)水平升高并可促進(jìn)NP發(fā)生[11-12]，但關(guān)于其具體作用機(jī)制及可能作用通路尚未解釋清楚。研究顯示在SNL大鼠模型鞘內(nèi)注射P300抑制劑可能通過抑制P300介導(dǎo)p65乙?；⒋偈购艘蜃应蔅（NF-κB）表達(dá)水平降低，這可為神經(jīng)疼痛的治療提供靶點(diǎn)[13]。本研究構(gòu)建CCI模型并采用siRNA-P300鞘內(nèi)注射觀察大鼠機(jī)械痛閾及熱痛閾變化，結(jié)果顯示術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組NP大鼠機(jī)械痛閾及熱痛閾均明顯降低，提示NP模型大鼠造模成功。術(shù)后5 d、14 d siRNA-P300組NP大鼠機(jī)械痛閾及熱痛閾均明顯高于模型組、陰性對(duì)照組，說明鞘內(nèi)注射P300的siRNA可有效提高NP大鼠痛閾，提示P300在NP發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組NP大鼠P300 mRNA、蛋白及Ac-H3蛋白表達(dá)水平均顯著高于假手術(shù)組，siRNA-P300組顯著低于模型組，其中組蛋白Ac-H3屬于P300乙?；饔玫孜颷14]，分析原因可能為siRNA-P300可通過抑制脊髓P300表達(dá)并減弱P300介導(dǎo)的組蛋白乙酰化作用進(jìn)而抑制下游疼痛基因表達(dá)。提示siRNA-P300鞘內(nèi)注射可提高NP大鼠痛閾。神經(jīng)免疫系統(tǒng)紊亂及炎癥介質(zhì)異常分泌可引發(fā)NP，因而探討siRNA-P300鞘內(nèi)注射對(duì)NP大鼠體內(nèi)炎性介質(zhì)的影響具有重要意義[15]。進(jìn)一步分析siRNA-P300鞘內(nèi)注射對(duì)NP大鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)及疼痛介質(zhì)的影響，結(jié)果顯示模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平均顯著高于假手術(shù)組，siRNA-P300組顯著低于模型組、陰性對(duì)照組;模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中IL-4與IL-10水平顯著低于假手術(shù)組，siRNA-P300組顯著高于模型組，其中疼痛介質(zhì)合成及分泌異常均可引起疼痛覺，神經(jīng)源性炎性因子激活又可進(jìn)一步促進(jìn)疼痛介質(zhì)分泌，SP物質(zhì)屬于速激肽并可與膜受體結(jié)合進(jìn)而增加神經(jīng)元放電導(dǎo)致疼痛覺的產(chǎn)生，5-HT可與神經(jīng)元受體結(jié)合并啟動(dòng)內(nèi)向電流進(jìn)而增加痛覺敏感性，GABA可與神經(jīng)元突出結(jié)構(gòu)相互作用進(jìn)而引發(fā)疼痛覺，同時(shí)促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β與抗炎因子IL-4、IL-10分泌紊亂可促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥發(fā)生進(jìn)而引起疼痛[16]。本研究結(jié)果表明促炎因子水平升高及抗炎因子水平降低可促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥發(fā)生并進(jìn)一步促進(jìn)疼痛介質(zhì)5-HT、SP、GABA異常分泌進(jìn)而引起NP的發(fā)生，鞘內(nèi)注射siRNA-P300可通過抑制促炎因子、疼痛介質(zhì)分泌并增加抗炎因子分泌進(jìn)而神經(jīng)源性炎癥從而減緩疼痛程度。提示鞘內(nèi)注射siRNA-P300可有效減輕NP大鼠疼痛程度。

ERK/CREB通路磷酸化可參與BDNF保護(hù)及修復(fù)背根神經(jīng)節(jié)過程，BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一并可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞分化及再生[17]。BDNF可與其受體結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)疼痛形成，抑制ERK/CREB通路可降低BDNF表達(dá)水平并有效改善CCI誘發(fā)痛覺過敏特征，ERK/CREB、BDNF通路激活可參與NP形成過程[18]。研究表明通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/ERK（MAPK/ERK）信號(hào)通路可降低HIF-1α、VEGF相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)而有效改善老年缺血性腦卒中患者認(rèn)知功能障礙[19]。推測(cè)ERK/CREB信號(hào)通路與HIF-1α/VEGF信號(hào)通路是否共同參與NP發(fā)生過程。呂翠巖等[20]研究表明通過抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)可對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)發(fā)揮保護(hù)作用。同時(shí)P300還可通過與CREB結(jié)合蛋白相互作用進(jìn)而參與NP發(fā)生及發(fā)展過程[21]。以上研究均表明ERK/CREB及HIF-1α/VEGF信號(hào)通路均與NP發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示模型組、陰性對(duì)照組及siRNA-P300組NP大鼠HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，siRNA-P300組低于模型組、陰性對(duì)照組，說明siRNA-P300可有效抑制ERK/CREB及HIF-1α/VEGF信號(hào)通路。提示siRNA-P300可能通過抑制HIF-1α/VEGF及ERK/CREB信號(hào)通路進(jìn)而抑制NP大鼠神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所述，鞘內(nèi)注射siRNA-P300可緩解NP大鼠神經(jīng)病理性疼痛，其可能作用機(jī)制與抑制HIF-1α/VEGF及ERK/CREB信號(hào)通路有關(guān)，其將會(huì)增加對(duì)NP發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)并可能成為治療NP的新靶點(diǎn)，為未來疼痛藥物的開發(fā)提供重要方向。但關(guān)于siRNA-P300可能通過作用于哪些蛋白發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用及其可能分子機(jī)制均需深入研究。

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