影響珍稀瀕危植物荷葉鐵線蕨孢子培養(yǎng)的環(huán)境因素研究

李 莉

（上海辰山植物園，城市園藝技術(shù)研發(fā)與推廣中心，上海 201600）

荷葉鐵線蕨（Adiantum nelumboides X.C.Zhang）為僅分布于中國(guó)三峽庫(kù)區(qū)的特有珍稀瀕危蕨類植物，其野外種群資源日趨減少，已被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。荷葉鐵線蕨的繁殖方式主要有分株繁殖和孢子繁殖兩種，孢子繁殖因其繁殖效率高而更有優(yōu)勢(shì)。為了為遷地保育提供技術(shù)依據(jù)，需要對(duì)孢子繁殖所需的環(huán)境因素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，確定繁殖效率最高的孢子培養(yǎng)條件。根據(jù)栽培過程中需要控制的各種環(huán)境因素進(jìn)行單因子控制對(duì)比試驗(yàn)，確定包括基質(zhì)、溫度、光照、播種密度、孢子貯藏時(shí)間及孢子消毒與否等環(huán)境因素的最佳條件，并探討孢子繁殖的技術(shù)要點(diǎn)，為荷葉鐵線蕨的繁殖、保護(hù)和資源利用提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，荷葉鐵線蕨孢子為需光萌發(fā)，孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育、幼孢子體生長(zhǎng)最適宜的環(huán)境條件為：基質(zhì)草炭∶蛭石=1∶1，溫度25℃，日光燈光照強(qiáng)度3 000 lux，播種密度25 pcs/cm2，貯藏時(shí)間1 m最佳，孢子不必要消毒。研究給出了荷葉鐵線蕨孢子繁殖的最佳環(huán)境條件，通過孢子繁殖可以獲取大量的有性繁殖個(gè)體，為荷葉鐵線蕨的保育提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

珍稀瀕危植物；荷葉鐵線蕨；孢子培養(yǎng)；環(huán)境因素

荷葉鐵線蕨（Adiantum nelumboides X.C.Zhang），又名“荷葉金錢草”，為鳳尾蕨科（Pteridaceae）書帶蕨亞科（Vittarioideae）鐵線蕨屬（Adiantum）的常綠植物，是一個(gè)獨(dú)立的物種[1-4]，為亞洲鐵線蕨屬植物中唯一的單葉型植物，因葉片類似于荷葉而得名（圖1）。1978年首次發(fā)現(xiàn)于中國(guó)四川省萬縣（現(xiàn)重慶市萬州區(qū)）[5]，作為三峽地區(qū)的特有植物之一，僅分布于重慶市萬州區(qū)和石柱縣的局部河谷地段，為中國(guó)特有珍稀瀕危蕨類植物，2021年被列入新發(fā)布的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》中，保護(hù)級(jí)別為I級(jí)[6]。依據(jù)國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（The International Union for Conservation of Nature，IUCN）標(biāo)準(zhǔn)，荷葉鐵線蕨受威脅等級(jí)被評(píng)估為極危（Critically Endangered，CR）[7]。研究表明，在過去近30年中，荷葉鐵線蕨幾乎遭受滅絕性的破壞，一方面由于荷葉鐵線蕨的藥用價(jià)值而遭到過度非法采集，野外資源大量減少；另一方面由于三峽工程的建設(shè)，修建水庫(kù)后水位上升，加上周邊配套公路、住房等的修建，導(dǎo)致荷葉鐵線蕨原生境的棲息地被破壞和片段化，野外種群數(shù)量急劇減少而面臨野外滅絕的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。因此人工繁育已成為挽救及保護(hù)荷葉鐵線蕨的重要措施。

圖1 荷葉鐵線蕨的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of Adiantum nelumboides

在自然環(huán)境中，荷葉鐵線蕨主要有無性繁殖（根狀莖萌蘗）和有性繁殖（孢子繁殖）兩種方式。人工繁育除了利用根狀莖萌蘗進(jìn)行分株繁殖和利用孢子萌發(fā)進(jìn)行孢子繁殖之外，還可以利用無菌培養(yǎng)和組培技術(shù)進(jìn)行快速繁殖。分株繁殖只需在根部進(jìn)行人工分離，操作簡(jiǎn)便，成活率較高[10]，但繁殖效率不高。無菌培養(yǎng)和組培技術(shù)結(jié)合可以利用孢子產(chǎn)生的配子體進(jìn)行大量擴(kuò)繁[11]，但由于無菌培養(yǎng)需要專業(yè)的技術(shù)和條件，組培產(chǎn)生的配子體適應(yīng)力差等原因而不具備生產(chǎn)價(jià)值。孢子繁殖屬于模仿自然的有性繁殖過程，利用容易獲取的大量孢子在基質(zhì)材料中萌發(fā)、產(chǎn)生原葉體、受精、產(chǎn)生幼孢子體的過程，最終得到成熟個(gè)體[12-14]。這種繁殖方式一方面成本較低、效率較高，另一方面屬于有性生殖而不容易出現(xiàn)種群退化的現(xiàn)象。

孢子繁殖技術(shù)是蕨類植物快速擴(kuò)繁的重要技術(shù)手段，荷葉鐵線蕨的孢子繁殖也受到了較多的關(guān)注。徐慧珠等[12]第一次提出利用孢子繁殖技術(shù)來擴(kuò)繁荷葉鐵線蕨，并通過實(shí)驗(yàn)研究確定孢子繁殖的繁殖周期隨光溫條件而變化，從播種到出現(xiàn)孢子體幼苗最短只需110 d左右。潘麗等[13]通過孢子的不同貯藏時(shí)間與培養(yǎng)條件對(duì)配子體和孢子體形成的影響研究發(fā)現(xiàn)，在室溫下保存5年以上依然具有活力。張祖榮等[14]通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在保證水分的條件下，無菌環(huán)境、白天光照和自然變溫可以獲得更好的繁殖效率。但上述研究都沒有系統(tǒng)給出完整外部環(huán)境因素的最佳條件，開展荷葉鐵線蕨孢子繁殖環(huán)境因素研究成為繁育體系標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)。

本研究在前人研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上摸索了一批環(huán)境變量的最佳條件，同時(shí)為了便于實(shí)驗(yàn)開展，最終的可控條件將溫度調(diào)整為室溫（20～25℃）、孢子選擇不消毒作為單因素對(duì)比實(shí)驗(yàn)的受控條件。在受控條件一致的情況下，通過單因子對(duì)比試驗(yàn)，逐一探討了不同基質(zhì)、溫度、光照條件、播種密度、孢子貯藏時(shí)間及孢子消毒與否等各環(huán)境因素對(duì)荷葉鐵線蕨孢子繁殖的影響，以期為該種建立繁殖體系、種質(zhì)資源保護(hù)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 孢子的采集保存

荷葉鐵線蕨孢子采集于重慶市萬州區(qū)石柱縣，經(jīng)干燥后保存，播種至上海辰山植物園保種溫室，成苗后取其新產(chǎn)生的孢子作為實(shí)驗(yàn)材料。采集孢子時(shí)，將成熟的孢子葉剪下放入自制硫酸紙帶中，置于封口袋中，使用變色硅膠干燥7～10 d。孢子可自然脫落。收集孢子時(shí)，輕輕拍打硫酸紙袋使孢子充分脫落，移至干凈的硫酸紙上去除葉片及孢子囊群蓋，再將孢子收集于離心管內(nèi)，放置于4℃冰箱保存。

1.2 孢子消毒與定量播種方法

孢子的消毒方法參照徐艷等[15]關(guān)于江南星蕨配子體形態(tài)發(fā)育的研究中使用的方法，取適量成熟孢子置于1.5 ml離心管中，加入5%NaClO水溶液1 ml消毒5 min，離心5 min，沉淀用無菌水沖洗5遍。

采集的孢子適量置于50 ml離心管中，用移液槍精確滴加適量無菌水，制成孢子懸濁液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行檢測(cè)，制成高濃度的孢子母液，用移液槍精確取適量進(jìn)行無菌水稀釋，按照播種基質(zhì)面積及所需孢子數(shù)量，最終制成濃度為25 pcs/cm2水溶液。

1.3 播種方法與盆器選擇

前期研究對(duì)于盆器的選擇沒有特殊要求，郭治友[16]在進(jìn)行金毛狗孢子繁殖研究中選擇紫砂花盆作為盆器，并用保鮮膜進(jìn)行保濕處理；周淑香等[17]在進(jìn)行巢蕨孢子繁殖及栽培技術(shù)研究中選用苗床作為盆器，蓋上透明玻璃保濕；岳曉晶等[18]在對(duì)開蕨繁殖技術(shù)研究時(shí)選用圓形塑料盆作為盆器；孫起夢(mèng)[19]對(duì)幾種蕨類植物的孢子繁殖試驗(yàn)研究中運(yùn)用瓦盆作為栽培盆器?？梢娕杵鲗?duì)孢子繁殖的影響不大，只要能夠保持足夠的濕度即可。

結(jié)合理論及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，最終選用三件套式播種盒。該播種盒主要分為三個(gè)部分：盒身（無洞）、厚1～2 cm的保水棉、透明蓋。盒身為主要的孢子播種盆器，保水棉以上還需要加入播種基質(zhì)，透明蓋主要用于保濕和透光。

播種時(shí)將所需基質(zhì)用網(wǎng)孔直徑為2 mm的細(xì)篩篩出細(xì)壤，121℃滅菌鍋20 min。將滅菌后的基質(zhì)放入三件套式播種盒內(nèi)，使基質(zhì)平整，基質(zhì)厚度為3 cm，基質(zhì)浸潤(rùn)，將稀釋好的孢子水溶液均勻播撒于基質(zhì)表面，并用透明蓋蓋住即可。

1.4 孢子培養(yǎng)

結(jié)合前人對(duì)于孢子繁殖方法，經(jīng)過前期反復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在可控制條件下分別對(duì)栽培基質(zhì)、溫度、光照強(qiáng)度、播種密度、孢子貯藏時(shí)間及孢子消毒與否進(jìn)行單因素對(duì)比培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因子均設(shè)5組重復(fù)。

（1）栽培基質(zhì)。選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，在播種密度為25 pcs/cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下培養(yǎng)。共設(shè)置8個(gè)基質(zhì)對(duì)比。各基質(zhì)見表1。

表1 栽培基質(zhì)明細(xì)Tab.1 Details of culture substrate

（2）溫度對(duì)比實(shí)驗(yàn)。選用孢子貯藏時(shí)間為1 m?；|(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs/cm2，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下培養(yǎng)，溫度分別設(shè)置為15℃、20℃、25℃、30℃、室溫20～25℃，共5個(gè)對(duì)比。

（3）光照強(qiáng)度對(duì)比實(shí)驗(yàn)。選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs/cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度分別設(shè)置為0 lux（暗環(huán)境）、1 000 lux、2 000 lux、3 000 lux、5 000 lux、10 000 lux、15 000 lux共7個(gè)對(duì)比。

（4）播種密度對(duì)比實(shí)驗(yàn)。選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下培養(yǎng)，播種密度分別設(shè)置為：5 pcs/cm2、10 pcs/cm2、15 pcs/cm2、25 pcs/cm2、35 pcs/cm2、50 pcs/cm2、65 pcs/cm2、80 pcs/cm2、100 pcs/cm2、120 pcs/cm2，共10個(gè)對(duì)比。

（5）孢子貯藏時(shí)間對(duì)比實(shí)驗(yàn)。選用基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs/cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下培養(yǎng)，孢子貯藏時(shí)間分別設(shè)置為1 m、3 m、1 y、2 y、5 y，共5個(gè)對(duì)比。

（6）孢子消毒與否對(duì)比實(shí)驗(yàn)。選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs /cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下培養(yǎng)，孢子消毒及未消毒處理。

（7）觀察記錄與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。播種3 d后進(jìn)行定時(shí)觀察，測(cè)量、拍照記錄配子體的萌發(fā)、發(fā)育、孢子體萌發(fā)情況，具體記錄（播種時(shí)間、配子體萌發(fā)的天數(shù)、配子體萌發(fā)的數(shù)量、配子體萌發(fā)率、孢子體萌發(fā)的天數(shù)、孢子體萌發(fā)的數(shù)量、孢子體萌發(fā)率、配子體到幼孢子體的轉(zhuǎn)化率等）。將5個(gè)重復(fù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)平均值。所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0在P=0.05水平上進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培基質(zhì)對(duì)荷葉鐵線蕨孢子繁殖的影響

從圖2、表2可見，荷葉鐵線蕨在選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，在播種密度為25 pcs/cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lux條件下，基質(zhì)1、2、3配子體萌發(fā)數(shù)量較高，基質(zhì)1配子體轉(zhuǎn)化成幼孢子體轉(zhuǎn)化率最高、幼孢子體萌發(fā)數(shù)量上最多。各基質(zhì)在配子體萌發(fā)時(shí)間差異性不顯著，基質(zhì)1在幼孢子體萌發(fā)時(shí)間最短。綜上，基質(zhì)1，即草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），為荷葉鐵線蕨孢子繁殖的適宜基質(zhì)。

圖2 栽培基質(zhì)對(duì)配子體、幼孢子體發(fā)育的影響Fig.2 Effect of culture substrate on the development of gametophyte and young sporophyte

表2 栽培基質(zhì)對(duì)配子體、幼孢子體萌發(fā)時(shí)間的影響Tab.2 Effect of culture substrate on the germination time of gametophyte and young sporophyte

2.2 溫度對(duì)荷葉鐵線蕨孢子繁殖的影響

從圖3、表3可見，選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs/cm2，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下，溫度條件15℃、30℃條件下未能產(chǎn)生幼孢子體，20℃、25℃及室溫20～25℃均產(chǎn)生了幼孢子體，在配子體及幼孢子體萌發(fā)時(shí)間上，三者無顯著性差異。25℃在配子體數(shù)量及幼孢子體數(shù)量最多，轉(zhuǎn)化率最高。25℃及室溫20～25℃條件下，配子體及幼孢子體萌發(fā)時(shí)間差異性不顯著。25℃在孢子繁殖最終目標(biāo)即幼孢子體數(shù)量為最多。從人工成本及設(shè)施設(shè)備考慮，室溫20～25℃是可接受的條件選擇。

圖3 溫度對(duì)配子體、幼孢子體發(fā)育的影響Fig.3 Effect of temperature on the development of gametophyte and young sporophyte

表3 溫度對(duì)配子體、幼孢子體萌發(fā)時(shí)間的影響Tab.3 Effect of temperature on the germination time of gametophyte and young sporophyte

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)荷葉鐵線蕨孢子繁殖的影響

從圖4、表4可見，選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs/cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照條件下，3 000 lux條件下，配子體的最早萌發(fā)時(shí)間次于2 000 lux，幼孢子體的最早萌發(fā)時(shí)間為最短。在幼孢子萌發(fā)的時(shí)間、配子體及幼孢子體萌發(fā)數(shù)量都高于其他光照條件，同時(shí)配子體轉(zhuǎn)化成幼孢子體的轉(zhuǎn)化率也是最高，差異顯著。綜上，3 000 lux為荷葉鐵線蕨孢子萌發(fā)最佳光照條件。

圖4 光照強(qiáng)度對(duì)配子體、幼孢子體發(fā)育的影響Fig.4 Effect of illumination intensity on the development of gametophyte and young sporophyte

表4 光照強(qiáng)度對(duì)配子體、幼孢子體萌發(fā)時(shí)間的影響Tab.4 Effect of illumination intensity on the germination time of gametophyte and young sporophyte

2.4 播種密度對(duì)荷葉鐵線蕨孢子繁殖的影響

從圖5、表5可見，選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下，播種密度為25 pcs/cm2在配子體萌發(fā)時(shí)間、配子體及幼孢子體萌發(fā)數(shù)量，轉(zhuǎn)化率均最高，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異。因此播種密度25 pcs/ cm2為最佳密度條件。

圖5 密度對(duì)配子體、幼孢子體發(fā)育的影響Fig.5 Effect of density on the development of gametophyte and young sporophyte

表5 密度對(duì)配子體、幼孢子體萌發(fā)時(shí)間的影響Tab.5 Effect of density on the germination time of gametophyte and young sporophyte

2.5 孢子貯藏時(shí)間對(duì)荷葉鐵線蕨孢子繁殖的影響

從圖6、表6可見，選用基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs/cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下，隨著孢子貯藏時(shí)間的遞增，在配子體及幼孢子體的萌發(fā)時(shí)間逐漸增加、在配子體、幼孢子體數(shù)量及轉(zhuǎn)化率各方面均逐漸降低。因此貯藏時(shí)間對(duì)孢子體活性有直接的影響，時(shí)間越短，孢子活性越強(qiáng)。在本研究對(duì)比中時(shí)間最短的1 m最佳。

表6 孢子貯藏時(shí)間對(duì)配子體、幼孢子體萌發(fā)時(shí)間的影響Tab.6 Effect of spore storage time on the germination time of gametophyte and young sporophyte

圖6 孢子貯藏時(shí)間對(duì)配子體、幼孢子體發(fā)育的影響Fig.6 Effect of spore storage time on the development of gametophyte and young sporophyte

2.6 孢子消毒與否對(duì)荷葉鐵線蕨孢子繁殖的影響

從圖7、表7可見，選用孢子貯藏時(shí)間為1 m，基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1（高溫消毒），在播種密度為25 pcs/cm2，環(huán)境室溫控制在20～25℃，置于12 h/d光照，光照強(qiáng)度為3 000 lux條件下，孢子消毒與否在各方面的優(yōu)勢(shì)度不明顯，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。綜上，孢子消毒與否并非荷葉鐵線蕨孢子繁殖的技術(shù)要點(diǎn)。從人工成本及設(shè)施設(shè)備考慮，不消毒即可。

表7 孢子消毒與否對(duì)配子體、幼孢子體萌發(fā)時(shí)間的影響Tab.7 Effect of spore disinfection or not on the germination time of gametophyte and young sporophyte

圖7 孢子消毒與否對(duì)配子體、幼孢子體發(fā)育的影響Fig.7 Effect of spore disinfection or not on the development of gametophyte and young sporophyte

2.7 栽培養(yǎng)護(hù)管理

荷葉鐵線蕨孢子繁殖在播種后需定期觀察盆內(nèi)基質(zhì)含水情況，在基質(zhì)完全浸潤(rùn)條件下，配子體萌發(fā)前無須加水，配子體萌發(fā)后須定期觀察，及時(shí)加水。對(duì)于盆內(nèi)萌發(fā)的苔蘚、藻類、霉菌進(jìn)行及時(shí)清除。

孢子體幼苗長(zhǎng)出4～5片真葉后即可移栽，基質(zhì)種類包括：草炭、蛭石、腐葉土、赤玉土。腐葉土須進(jìn)行暴曬曬干，適當(dāng)研磨，取小于2 mm的基質(zhì)；基質(zhì)配比為草炭∶蛭石∶腐葉土∶赤玉土=1∶1∶1∶1。移栽到準(zhǔn)備好的12孔穴盤中進(jìn)行培育，移栽密度500 株/m2。種完后1 h內(nèi)澆定根水，并于澆水后30 min后檢查，盆內(nèi)基質(zhì)呈濕潤(rùn)狀態(tài)；定期觀察，及時(shí)加水，濕度控制在80%以上最佳，光照12 h/d，光照強(qiáng)度5 000～8 000 lux，溫度10～25℃。

幼孢子體長(zhǎng)成高度為5 cm，葉片為10～20片葉子后，移栽到準(zhǔn)備好的三寸盆中進(jìn)行培育，移栽密度120 株/m2。種完后1 h內(nèi)澆定根水，澆水后30 min檢查，盆內(nèi)基質(zhì)呈濕潤(rùn)狀態(tài)。同時(shí)在移栽后的7 d用透明蓋子進(jìn)行保濕，確保在根系未完全生長(zhǎng)良好前，以免發(fā)生葉片蒸騰作用大于根系吸收水分功能的后果。移栽1 m后開始薄施水肥，15 d施1次。做好盆土水分控制、除草、除蟲、病蟲害防治等管理工作，以保證植物生長(zhǎng)良好。

3 討論

從栽培基質(zhì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中能看出，基質(zhì)消毒整體比未消毒在各數(shù)據(jù)上有顯著性差異，消毒的基質(zhì)更好。原因可能為基質(zhì)在消毒過程中消滅了所有的菌類，而菌類勢(shì)必會(huì)影響荷葉鐵線蕨的整個(gè)繁殖過程。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)1與基質(zhì)2在配子體、幼孢子體的萌發(fā)數(shù)量及轉(zhuǎn)化率方面，都是肥力較弱的基質(zhì)1優(yōu)勢(shì)明顯，因此本研究懷疑荷葉鐵線蕨的孢子繁殖過程中的配子體萌發(fā)、性器官的發(fā)育對(duì)于基質(zhì)肥力要求不高。

溫度是促進(jìn)孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育重要的因素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低溫15℃有配子體的萌發(fā)，但是未產(chǎn)生幼孢子體的萌發(fā)，低溫可能抑制了性器官的發(fā)育及受精，而高溫30℃抑制孢子的萌發(fā)。在一定范圍內(nèi)，溫度的升高可以促進(jìn)配子體萌發(fā)及幼孢子體萌發(fā)，25℃是荷葉鐵線蕨的適合溫度，這和很多其他蕨類植物適宜溫度一致[20-21]。

光照強(qiáng)度是孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育重要的因素。無光條件下，荷葉鐵線蕨孢子無法發(fā)育。各光照強(qiáng)度下孢子都能進(jìn)行萌發(fā)，光照強(qiáng)度對(duì)配子體及幼孢子體萌發(fā)的時(shí)間影響較為明顯，3 000 lux的光照條件比15 000 lux條件下配子體萌發(fā)時(shí)間早4 d以上，幼孢子體萌發(fā)時(shí)間早20 d以上。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)密度較低時(shí)，配子體間距離較大，不利于受精，難以形成幼孢子體；相反，當(dāng)培養(yǎng)密度過高時(shí)配子體發(fā)育遲緩、長(zhǎng)勢(shì)較弱，幼孢子體的萌發(fā)率也較低，因此荷葉鐵線蕨的理想培養(yǎng)密度為25 pcs/cm2。

荷葉鐵線蕨為不含葉綠素的孢子。本研究證實(shí)貯藏5年的孢子仍有一定活性，具有良好的孢子萌發(fā)力。隨著貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，配子體、幼孢子體的萌發(fā)數(shù)量及轉(zhuǎn)化率等方面也隨之逐步降低。因此荷葉鐵線蕨孢子的播種應(yīng)選擇采收后及時(shí)播種，活性最大，得苗率最高。

綜上所述，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果推斷荷葉鐵線蕨在基質(zhì)為草炭∶蛭石=1∶1，溫度25℃，日光燈光照強(qiáng)度為3 000 lux、播種密度25 pcs/cm2、貯藏時(shí)間1 m，同時(shí)孢子不必消毒的條件下繁殖最快、最多，可建立荷葉鐵線蕨的繁殖技術(shù)體系（圖8），從而實(shí)現(xiàn)快速獲得種苗的方法，具有實(shí)際指導(dǎo)的意義。

圖8 荷葉鐵線蕨孢子繁殖各階段形態(tài)Fig.8 Various stages of spore propagation in Adiantum nelumboides

注：文中圖片均由作者拍攝、繪制。