PTHrP、MCT1信號通路對非小細胞肺癌細胞衰老的調(diào)節(jié)機制研究

賀黎升　馬麗梅　羅金風　段艷

[摘要] 目的 研究探討甲狀旁腺激素相關蛋白（PTHrP）、單羧酸轉運泵家族1（MCT1）信號通路對非小細胞肺癌衰老的調(diào)節(jié)機制。方法 將2014年5月—2018年5月在該醫(yī)院培養(yǎng)的80孔非小細胞肺癌A549細胞分為A、B、C、D共4組，每組20孔。其中A組細胞中加入PTHrP信號通路抑制劑、B組細胞加入MCT1信號通路抑制劑、C組細胞加入PTHrP信號通路激活劑、D組細胞加入等量的PBS培養(yǎng)液，4組細胞經(jīng)聯(lián)系72 h培養(yǎng)。采用β-半乳糖苷酶染色法（β-Gal）觀察4組細胞的衰老程度。對4組細胞進行PCR擴增，以實時熒光定量PCR方法檢測PTHrP mRNA、MCT1 mRNA的表達量。并對各組細胞中pHi染色小體的和細胞外乳酸水平進行檢測比較。并采用Pearson檢驗對各指標間進行相關性分析。結果 ①4組細胞間β-Gal染色陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中A組、B組陽性率（13.98±2.53）%、（14.23±3.21）%均高于D組（10.09±2.98）%，C組陽性率（8.29±2.10）%則低于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。②4組細胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中A組、B組PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量[（7.09±1.53）、（5.29±1.22）;（7.26±1.61）、（4.98±1.17）]低于D組[（9.13±1.98）、（7.19±1.68）]，而C組表達率[（12.32±2.09）、（9.57±1.98）]則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。③4組細胞的pHi染色小體的和細胞外乳酸水平比較有統(tǒng)計學差異，A組、B組pHi染色小體水平高于D組，C組則低于D組，A組、B組細胞外乳酸水平低于D組，C組則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。④ Pearson相關性檢驗顯示，各組細胞的β-Gal染色陽性率（即衰老程度）與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量呈負相關性，與pHi染色小體水平呈正相關性，與細胞外乳酸水平呈負相關性（P<0.05）。結論PTHrP、MCT1信號通路狀態(tài)可以對非小細胞肺癌細胞的衰老起到調(diào)節(jié)作用，PTHrP、MCT1間相互影響，共同調(diào)節(jié)肺癌細胞的乳酸轉運過程。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌;細胞衰老;甲狀旁腺激素相關蛋白;單羧酸轉運泵家族1

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）07（c）-0030-04

Regulatory Mechanism of PTHrP and MCT1 Signaling Pathway on Senescence of Non-small Cell Lung Cancer Cells

HE Li-sheng1， MA Li-mei2， LUO Jin-feng1， DUAN Yan1

1.Department of Pathology， Shenzhen People's Hospital， Shenzhen， Guangdong Province， 518020 China; 2.Department of Pathology， Third People's Hospital of Zigong City， Zigong， Sichuan Province， 643020 China

[Abstract] Objective To investigate the regulation mechanism of parathyroid hormone-related protein （PTHrP） and monocarboxylate transport pump family 1 （MCT1） signaling pathway on the senescence of non-small cell lung cancer. Methods The A549 cells of 80-well non-small cell lung cancer cultured in People's Hospital from May 2014 to May 2018 were divided into 4 groups： A， B， C， and D， each with 20 holes. In group A， PTHrP signaling pathway inhibitor was added， group B cells were added with MCT1 signaling pathway inhibitor， group C cells were added with PTHrP signaling pathway activator， group D cells were added with equal amount of PBS medium， and four groups of cells were cultured for 72 h. The degree of senescence of the four groups of cells was observed by β-galactosidase staining （β-Gal）. Four groups of cells were subjected to PCR amplification， and the expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The pHi staining and extracellular lactate levels in each group of cells were detected and compared. Correlation analysis was carried out between the indicators using the Pearson test. Results 1.There was a statistically significant difference（P<0.05） in the positive rate of β-Gal staining between the four groups. The positive rate of group A and group B （13.98±2.53）% and （14.23±3.21）% were higher than those of group D （10.09±2.98）%. The positive rate of group C （8.29±2.10）% was lower than that of group D， and there was significant significant difference between the groups （P<0.05）. 2.The expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA in the four groups of cells were statistically significant（P<0.05）. The expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA in group A and group B were （7.09±1.53）， （5.29±1.22）; （7.26±1.61）（4.98±1.17）]， lower than group D [（9.13±1.98）， （7.19±1.68）]， and the expression rate of group C [（12.32±2.09）， （9.57±1.98）]， higher than group D， and there were significant significant differences between the groups （P<0.05）. 3.There were significant significant differences in pHi staining and extracellular lactate levels between the three groups of cells. The pHi staining level of group A and group B was higher than that of group D， and that of group C was lower than that of group D， group A and group B. The level of external lactate was lower than that of group D， and that of group C was higher than that of group D. There was statistically significant difference between groups （P<0.05）. 4.Pearson correlation test showed that the positive rate of β-Gal staining （ie， aging） of each group was negatively correlated with the expression of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA， and positively correlated with the level of pHi staining， and the level of extracellular lactate of negative correlation （P<0.05）. Conclusion The state of PTHrP and MCT1 signaling pathway can regulate the senescence of non-small cell lung cancer cells. PTHrP and MCT1 interact with each other to regulate the lactic acid transport process of lung cancer cells.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Cell senescence; Parathyroid hormone-related protein; Monocarboxylic acid transport pump family 1

肺癌是臨床上發(fā)病率較高的惡性腫瘤疾病，對人類健康的威脅性很大，在眾多的肺癌患者中以非小細胞肺癌最為多見，約占肺癌臨床患者的80%左右。隨著對人類生命健康威脅程度的加深，研究人員對非小細胞肺癌發(fā)病、病情進展等機制的研究不斷深入，其中非小細胞肺癌的癌細胞衰老過程的引起了更多的關注[1]。相關報道顯示[2-3]，非小細胞肺癌患者體內(nèi)的一些轉運蛋白、生物標記物的水平的改變會對患者癌細胞的衰老過程發(fā)揮一定的作用。其中，甲狀旁腺激素相關蛋白（Parathyroid hormone related protein， PTHrP）、單羧酸轉運泵家族1（Monarboxylic acid transfer pump family 1， MCT1）信號通路開放過程可能對非小細胞肺癌衰老過程有一定的調(diào)控作用[4-5]。為了進一步證實這一臨床推斷，以便更好地了解非小細胞肺癌細胞的凋亡機制，以期能夠為該類癌癥的治療提供依據(jù)。在該研究選取2014年5月—2018年5月該醫(yī)院提供培養(yǎng)得到的80孔非小細胞肺癌A549細胞，分別加入THrP信號通路抑制劑、MCT1信號通路抑制劑、PTHrP信號通路激活劑，觀察其對癌細胞衰老的影響，現(xiàn)報道如下。

1? 材料與方法

1.1? 材料和儀器

材料：非小細胞肺癌A549細胞購自于中科院上海細胞生物研究所;PTHrP、MCT1試劑盒、RNA提取試劑盒、β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色試劑盒、乳酸檢測試劑盒等均購置于賽默飛世爾科技有限公司。儀器：KS48型PCR擴增儀（冠森生物科技（上海）有限公司）;A8543紫外分光光度計（美國安捷倫科技有限公司）;CX-31型電子顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.2? 研究方法

取非小細胞肺癌A549細胞80株分為A、B、C、D共4組，其中A組細胞中加入PTHrP信號通路抑制劑、B組細胞加入MCT1信號通路抑制劑、C組細胞加入PTHrP信號通路激活劑、D組細胞加入等量的PBS培養(yǎng)液，4組細胞經(jīng)聯(lián)系72 h培養(yǎng)。對各種細胞培養(yǎng)后進行β-Gal染色，經(jīng)漂洗、固定、孵育48 h后于顯微鏡下觀察，在視野下觀察并隨機選取100個染色細胞，測定每個細胞中的染色面積并與細胞總面積進行對比，取比值作為染色陽性率，即表示為細胞的衰老程度。然后采用熒光定量PCR擴增技術檢測各組細胞中的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達水平。并采用熒光分光光度法對各組細胞的pHi染色小體的和細胞外乳酸水平。各檢查方法均嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。

1.3? 評價指標

對4組細胞的β-Gal染色陽性率、PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量、細胞pHi、乳酸水平進行統(tǒng)計比較，并對β-Gal染色陽性率與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量、細胞pHi、乳酸水平間相關性進行分析探討。

1.4? 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料、計數(shù)資料分別用（x±s）、[n（%）]表示，組別比較分別采用t檢驗/F檢驗、χ2檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1? 各組β-Gal染色陽性率比較

4組細胞間β-Gal染色陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中A組、B組陽性率均高于D組，C組陽性率則低于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2? 各組PTHrPmRNA、MCT1mRNA表達量比較

4組細胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量比較差異有統(tǒng)計學意義，其中A組、B組PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量低于D組，而C組表達率則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.3? 各組細胞pHi、乳酸水平比較

4組細胞的pHi染色小體的和細胞外乳酸水平比較有統(tǒng)計學差異，A組、B組pHi染色小體水平高于D組，C組則低于D組，A組、B組細胞外乳酸水平低于D組，C組則高于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

2.4? Pearson相關性分析

Pearson相關性檢驗顯示，各組細胞的β-Gal染色陽性率（即衰老程度）與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量呈負相關性，與pHi染色小體水平呈正相關性，與細胞外乳酸水平呈負相關性（P<0.05），見表4。

3? 討論

PTHrP、MCT1是兩種人體常見的生物標記蛋白，其中PTHrP為甲狀旁腺激素相關蛋白，是甲狀腺內(nèi)分泌過程形成的一種蛋白標記物，其在各種癌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的信號通路的介導作用[6-7]。具體的主要是通過影響癌細胞的細胞周期性，并由此對癌細胞的增殖、生長及凋亡過程產(chǎn)生一定的作用，當其在體內(nèi)的水平升高時，PTHrP信號通路大量被激活，癌細胞的增殖生長過程加快，反之當PTHrP水平下調(diào)時，PTHrP信號通路關閉，癌細胞增殖生長過程被抑制，加速了癌細胞的衰老和凋亡過程[8]。這種PTHrP信號通路的調(diào)節(jié)過程的變化能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長能力，并可能改變腫瘤的侵襲轉移能力和腫瘤細胞的衰老過程[9]。MCT1是單羧酸轉運泵家族中的一種，主要分布在患者體內(nèi)癌細胞的表面，對癌癥患者的癌細胞的乳酸有較好的親和力，通過與乳酸結合后的跨膜轉運過程，從而加速腫瘤細胞的代謝，調(diào)節(jié)腫瘤細胞衰老凋亡過程[10]。

在該研究中，4組細胞間β-Gal染色陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中A組、B組陽性率（13.98±2.53）%、（14.23±3.21）%均高于D組（10.09±2.98）%，C組陽性率（8.29±2.10）%則低于D組，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步的PCR擴增結果顯示，4組細胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中A組、B組PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量低于D組， C組表達率則高于D組。而4組細胞的pHi染色小體的和細胞外乳酸水平比較差異有統(tǒng)計學意義，A組、B組pHi染色小體水平高于D組，C組則低于D組，A組、B組細胞外乳酸水平低于D組，C組則高于D組。以上結果均表明PTHrP、MCT1水平增加，相應的信號通路被激活，導致β-Gal染色陽性率降低，衰老細胞表達減少。這與李永頔等[11]學者在相關實驗中得出，細胞中加入PTHrP信號通路抑制劑的β-Gal染色陽性率（13.65±2.47）%、細胞加入MCT1信號通路抑制劑的β-Gal染色陽性率（13.68±3.31）%、細胞加入PTHrP信號通路激活劑的β-Gal染色陽性率（8.35±2.05）%、細胞加入等量的PBS培養(yǎng)液的β-Gal染色陽性率（10.15±2.30）%的結果相近。當加入PTHrP、MCT1抑制劑后，衰老細胞顯著增加，加速癌細胞的凋亡[12]。而各組細胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量、pHi染色小體水平、外周乳酸水平的變化，表明了這些指標的表達過程參與了PTHrP、MCT1信號通路對癌細胞衰老凋亡的影響過程[13-14]。相關性檢驗結果顯示，各組細胞的β-Gal染色陽性率與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達量呈負相關性，與pHi染色小體水平呈正相關性，與細胞外乳酸水平呈負相關性，進一步表明癌細胞衰老過程受PTHrP、MCT1信號通路調(diào)控，并與PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表達、pHi染色小體和細胞外乳酸水平相關。

綜上所述，當非小細胞肺癌患者體內(nèi)PTHrP、MCT1信號通路被激活，mRNA表達量顯著增加，進一步導致細胞pHi水平降低，外周乳酸水平升高，進而使得非小細胞肺癌患者衰老細胞數(shù)量降低。因此，通過對PTHrP、MCT1信號通路狀態(tài)的抑制條件，共同抑制肺癌細胞的乳酸轉運過程，加速非小細胞肺癌細胞的衰老。

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（收稿日期：2019-04-25）