QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定土壤中61種激素類藥物殘留

任雪冬，王 璐，熊 爽

(遼寧省分析科學研究院，遼寧 沈陽 110015)

20世紀70年代，激素類藥物開始應用于養(yǎng)殖業(yè)，以促進動物生長，提高飼料轉化率，從而盡快產生顯著和直接的經(jīng)濟效益[1]。但是激素類藥物在動物體內不能完全代謝降解，隨畜禽糞便和尿液排出的比例較高。大量未經(jīng)處理的畜禽糞尿以及隨意丟棄的含激素的藥物、化妝品、保健食品等進入土壤環(huán)境后，會對土壤環(huán)境和動植物產生不利影響，進而危害人體健康[2-3]。因此，建立土壤中多種激素類藥物殘留的同時檢測方法具有重要意義。

針對不同領域中激素殘留的檢測已有較多文獻報道和標準檢測方法[4-19]。其中，土壤中激素殘留的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)，但GC-MS法需要復雜的衍生化操作。LC-MS/MS法無需衍生化，可同時測定多個目標化合物，且具有高選擇性、高靈敏度、高通量的優(yōu)勢，能夠滿足檢測要求。測定土壤中少數(shù)幾種激素殘留的LC-MS/MS法已有報道[20]，但同時測定土壤中61種激素殘留的LC-MS/MS法尚未見報道。

土壤中激素類檢測的樣品前處理方法主要有索氏提取法、微波提取法、超聲提取法、基質固相分散萃取法(MSPD)和加速溶劑萃取法(PLE)等。但傳統(tǒng)方法的步驟繁瑣、提取時間長、耗費有機溶劑，且回收率較低[20]。QuEChERS法是于2003年正式發(fā)布的一種新型前處理方法，具有效率高、成本低、操作簡單、穩(wěn)定性好、對環(huán)境及操作人員危害小等優(yōu)點。該方法得到美國分析化學家協(xié)會(AOAC)和歐盟農殘監(jiān)測委員會的認可，已應用于植物、動物和環(huán)境樣品中農、獸藥殘留及環(huán)境污染物等多類化合物的檢測[21]。但采用QuEChERS前處理方法同時測定土壤中61種激素殘留的研究尚未見報道。

本文采用QuEChERS技術進行樣品前處理，通過優(yōu)化樣品前處理及色譜-質譜分析條件，建立了同時測定土壤中61種激素殘留(4種雌激素、6種孕激素、5種雄激素、42種糖皮質激素和4種非甾體類激素)的高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)法，可為土壤中激素類殘留的定性、定量分析提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200/6410B液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；CT14RD離心機(天美科學儀器有限公司)；TTL-DCⅡ型水浴式氮吹濃縮儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；IKA快速混勻器(德國IKA公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

61種激素標準品的純度均大于95.6%(購于德國Dr.Ehrenstorfer公司、加拿大Trc公司和中國藥品生物制品檢定所);吸附劑：N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)、中性氧化鋁(Alu-N)、石墨化炭黑(GCB)(天津博納艾杰爾科技有限公司)；甲醇(美國Fisher公司)、乙腈(Sigma公司)、甲酸(迪馬公司)均為色譜純；無水硫酸鎂、氯化鈉、氨水(國藥集團化學試劑有限公司)均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取標準品各10.0 mg(精確至0.000 1 g)，置于10 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的單標儲備液，于-18 ℃下冷凍保存。分別取上述標準儲備溶液1.0 mL混合，用甲醇定容至100 mL，制成10.0 μg/mL的混合標準儲備溶液，于-18 ℃下冷凍保存。將上述混合標準儲備溶液用甲醇逐級稀釋成混合標準工作溶液，用于繪制標準曲線。

1.3 色譜條件

1.3.1 正離子模式色譜柱：ZORBAX SB-C18(1.8 μm，3.0 mm×100 mm)；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，68%B；3～12 min，68%～25%B；12～14 min，25%B；14～16 min，25%～68%B；保持9 min。

1.3.2 負離子模式色譜柱：ZORBAX Extend-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A為乙腈；B為0.1%氨水溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，70%B;1～1.01 min，70%～60%B；1.01～4 min，60%B；4～4.01 min，60%～40%B；4.01～7 min，40%B；7～7.01 min，40%～20%B；7.01～10 min，20%B；10～11 min，20%～30%B；11～15.1 min，30%～50%B；15.1～20 min，50%～70%B；保持10 min。

1.4 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正離子或負離子掃描模式；多反應監(jiān)測(MRM)采集方式；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：9.0 L/min；霧化氣壓力：241.3 kPa(35 psi)；毛細管電壓：4 000 V。各目標化合物的質譜采集參數(shù)見表1。

1.5 樣品制備

土壤樣品取自沈陽地區(qū)農田土、養(yǎng)殖場附近土壤和城區(qū)表層土(0～20 cm)，采用自然通風干燥，過60目篩后備用。

表1 61種激素的質譜采集參數(shù)Table 1 MS acquisition parameters of 61 kinds of hormones

(續(xù)表1)

CompoundRetention time(min)ESI modeParent ion(m/z)Product ion(m/z)Fragmentor(V)Collision energy(V)Prednicarbate(潑尼卡酯)16.37+489.2381.1,115.0*1003,10Halcinonide(哈西奈德)15.78+455.2120.9,105.0*15045,65Alclomethasone dipropionate(阿氯米松雙丙酸酯)17.82+521.2301.2*,279.211012,10Amcinonide(安西奈德)16.50+503.2338.8,321.1*10010,13Clobetasol 17-propionate(氯倍他索丙酸酯)16.23+467.2373.2*,354.91008,10Fluticasone propionate(氟替卡松丙酸酯)16.08+501.2313.1,293.1*1058,12Mometasone furoate(莫米他松糠酸酯)16.59+521.1503.0*,263.11003,20Betamethasone dipropionate(倍他米松雙丙酸酯)16.77+505.2318.9,279.1*10512,15Beclomtasone dipropionate(倍氯米松雙丙酸酯)16.60+521.2503.0*,319.11105,10Clobetasone 17-butyrate(氯倍他松丁酸酯)18.48+479.2342.9,278.9*13015,15Fluocinolone acetonide(氟輕松)10.98+453.2337.0,121.0*11010,40

*quantitation ion

1.6 樣品前處理

1.6.1 提 取取樣品5.0 g(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水，充分渦旋混勻1 min后，準確加入10.0 mL乙腈，渦旋混合2 min，再加入QuEChERS鹽析劑(4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉)，充分渦旋混勻后，置于冰水浴中降溫，在4 ℃下以9 000 r/min離心10 min，移取上清液于另一離心管中，待凈化。

1.6.2 凈 化在待凈化離心管中準確加入600 mg無水硫酸鎂、200 mg中性氧化鋁和200 mg PSA，充分渦旋混勻1 min，以9 000 r/min離心10 min后，移取上清液至10 mL具塞刻度試管中，于45 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，加入1.0 mL 30%乙腈水溶液復溶，渦旋30 s，過0.22 μm有機濾膜后，待測。

1.7 基質匹配工作曲線的繪制

取空白基質樣品，按“1.6”處理后濃縮至干，加入“1.2”配制的混合標準工作溶液，定容至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm有機濾膜后上機測定，繪制標準工作曲線。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

本文的61種激素包括57種甾體激素(4種雌激素、6種孕激素、5種雄激素和42種糖皮質激素)和4種非甾體類激素[1]。分別在正、負離子模式下對質譜條件進行優(yōu)化，結果表明：雌激素與玉米赤霉醇等二羥基苯甲酸內酯類化合物在ESI源的負離子模式下易電離，形成[M-H]-準分子離子，其中雌酮在負模式下的響應值遠大于正模式。其它激素類化合物在正離子模式下響應值高，形成[M+H]+準分子離子，其中醋酸氯地孕酮在正模式下的響應值比負模式高50%以上。在此基礎上，進一步優(yōu)化碎裂電壓(Fragmentor)、碰撞能量(Collision energy)使所有目標化合物的母離子和對應子離子的響應最大化，并選擇合適的干燥氣溫度、流速等條件使所有目標化合物均有良好的響應值。61種激素的質譜采集參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的選擇

根據(jù)目標化合物質譜行為的差異，分別建立正、負離子模式下的色譜條件。

圖1 正離子模式下53種激素的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of 53 hormones under positive ion mode

圖2 負離子模式下8種激素的提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 8 hormones under negative ion mode

正模式下：考察了4種不同流動相體系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液)的分離效果，結果表明，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相可獲得良好的色譜峰形及較高的靈敏度。進一步對比了ZORBAX SB-C18(1.8 μm，3.0 mm×100 mm)、ZORBAX SB-C18(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)和Eclipse XDB-C18(3.5 μm，4.6 mm×150 mm)色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)ZORBAX SB-C18(1.8 μm，3.0 mm×100 mm)對目標化合物的分離效果、靈敏度、色譜峰形均最優(yōu)。在“1.3.1”的最佳色譜條件下，53種激素的提取離子流圖見圖1。

負模式下：考察了2種不同流動相體系(乙腈-水、乙腈-0.1%氨水溶液)的分離效果，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%氨水溶液為流動相時目標化合物的分離效果、色譜峰形均最優(yōu)。由于流動相使用0.1%氨水溶液，其pH值達到10.0左右，因此選用可耐受pH 2.0～11.5范圍的ZORBAX Extend-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)色譜柱，達到了良好的分離效果。在“1.3.2”的最佳色譜條件下，其余8種激素的提取離子流圖見圖2。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 酶 解激素類藥物以游離或軛合物兩種形式存在，若檢測軛合物或總量，則前處理時樣品需要酶解[22]。然而，祝偉霞等[7]對奶粉與牛奶中內源性激素雌二醇與孕酮的研究顯示，酶解與不酶解的測定值無明顯差異；Shao等[23-24]研究顯示，動物肌肉組織中睪酮可解離的結合態(tài)<20%，17β-雌二醇<5%。Yang等[24]研究顯示，肌肉、蝦、牛奶中的內源性激素在酶解和無酶解條件下的測定結果無差異。雖然土壤中的動物排泄物(以尿、糞的形式)含有軛合物形式的激素，但在激素殘留總量中占比不高或極少，而正常情況下在城區(qū)、農村的土壤樣品中畜禽尿液、糞便的比例極低，為節(jié)約分析時間與成本，本實驗省略酶解步驟。若土壤樣品采自養(yǎng)殖場附近或糞尿農用農田，為保證數(shù)據(jù)準確性可進行酶解步驟。

2.3.2 QuEChERS樣品處理條件的優(yōu)化提取溶劑的選擇：61種激素類化合物多為弱極性或中等極性，根據(jù)其化學結構并參考國家標準及相關文獻[4,7,14,16,18]，考察了常用提取溶劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯的提取效果。結果顯示，甲醇的鹽析效果不佳；乙酸乙酯的共萃取物較多，不易凈化。而乙腈作為提取溶劑可以減少共提取物，同時具有沉淀蛋白的作用，因此選用乙腈為提取溶劑。

凈化條件的優(yōu)化:常用的吸附劑有PSA、C18、中性氧化鋁及GCB，其中PSA通常用于去除提取液中的脂類和糖類物質；C18及中性氧化鋁具有良好的除脂能力；GCB可去除提取液中的色素，但對含苯環(huán)官能團的化合物有較強的吸附作用[21，25]。本實驗對比了上述4種吸附劑對61種目標物的吸附情況，在200 μg/L混合標準溶液中分別加入上述吸附劑100 mg，充分混勻、離心后上機測定。結果顯示，GCB對待測物的吸附極強；C18對待測物也有很大吸附；而PSA與中性氧化鋁對大多數(shù)目標物的吸附較少，61種目標物的回收率分別為81.5%～103%和87.9%～103%，可作為凈化劑進一步優(yōu)化。根據(jù)土壤成分特點，進一步考察了PSA(50 ～1 000 mg)、中性氧化鋁(50～600 mg)及起脫水作用的無水硫酸鎂(200～1 000 mg)的用量。發(fā)現(xiàn)以200 mg PSA、200 mg中性氧化鋁及600 mg無水硫酸鎂為凈化劑組合的樣品基質干擾最小，回收率最好。優(yōu)化的樣品處理條件如“1.6”所示。

2.4 基質效應的影響

LC-MS/MS的基質效應由分析物的共流出組分影響電噴霧離子源的離子化效率所致，即待測組分與樣品中的基質成分在霧滴表面離子化過程存在競爭[26]。其競爭結果會顯著降低(離子抑制)或增加(離子增強)目標離子的生成效率及離子強度，進而影響測定結果的精密度和準確度?；|效應可采用(基質匹配標準溶液所作標準曲線的斜率/無基質標準溶液所作標準曲線的斜率-1)×100%進行評價[27]。負值表示存在基質抑制效應，正值表示存在基質增強效應，絕對值越大則表明基質效應越強。本實驗對61種化合物的基質效應進行了評價(見表2)，發(fā)現(xiàn)玉米赤霉醇、炔諾酮、倍他米松、潑尼松龍醋酸酯的基質效應較小，大部分化合物存在不同程度的增強或抑制效應，而以二氟拉松雙醋酸酯、阿氯米松雙丙酸酯、氯倍他索丙酸酯、莫米他松糠酸酯的基質效應最為明顯。本方法采用配制基質匹配標準工作溶液的方法消除基質影響，能夠滿足激素殘留的檢測要求。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

按“1.7”方法配制6個濃度水平的基質匹配混合標準工作溶液，上機測定，以待測物的質量濃度對其響應值繪制標準曲線。61種目標化合物在各自范圍內線性良好，相關系數(shù)(r2)為0.991 8～0.999 8。采用標準添加法進行測定，以定量離子信噪比S/N≥3得到61種目標化合物的檢出限(LOD)為0.01～2.3 μg/kg，以S/N≥10得到定量下限(LOQ)為0.03～7.5 μg/kg(見表2)。

表2 61種待測物的基質效應、檢出限、定量下限、線性范圍、平均回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Matrix effects,LOD,LOQ,linear ranges,average recoveries and relative standard deviations of 61 analytes(n=6)

(續(xù)表2)

CompoundMatrix effect(%)LOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)Linear range(μg/L)Added 10 μg/kgAdded 50 μg/kgAdded 200 μg/kgRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Dexamethasone 21-acetate5.200.41.32～20095.62.078.44.180.31.6Fluorometholone 17-acetate4.700.060.21～200102 1.184.83.586.42.0Hydrocortisone 17-valerare8.900.62.05～20096.82.989.11.995.31.3Triamcinolone acetonide acetate5.900.31.12～20096.92.785.62.793.91.5Fluocinonide7.100.62.05～20099.03.285.72.878.21.3Diflorasone diacetate27.60.92.95～20086.82.194.25.098.73.2Betamethasone 17-valerate15.20.82.75～20094.14.896.93.096.82.0Prednicarbate7.600.20.42～20098.13.386.52.079.72.5Halcinonide-4.400.61.85～20086.611102 2.094.42.0Alclomethasone dipropionate20.90.51.65～2001021.593.54.494.12.1Amcinonide5.900.20.62～20085.24.295.02.284.73.4Clobetasol 17-propionate21.00.20.65～20089.98.81012.799.02.6Fluticasone propionate9.800.20.62～20081.93.285.42.586.04.1Mometasone furoate22.40.31.15～20088.69.084.83.785.12.8Betamethasone dipropionate18.40.20.42～20092.26.992.13.41012.3Beclomtasone dipropionate8.600.41.15～20098.33.098.11.986.53.3Clobetasone 17-butyrate7.800.51.710～20089.99.878.22.888.23.1Fluocinolone acetonide7.700.93.05～20088.75.01022.999.93.9

2.6 回收率與相對標準偏差

向空白基質樣品中添加3個濃度水平(10、50、200 μg/kg)的61種目標化合物混合標準溶液，按“1.6”方法進行前處理后上機測定，每個濃度水平做6個平行實驗。計算得到61種待測物的平均回收率為62.6%～102%，相對標準偏差(RSD)為1.0%～11%(見表2)。

2.7 實際樣品的測定

利用本方法對沈陽地區(qū)不同地點采集的土壤樣品進行檢測，在1份樣品中檢出雌三醇，含量為5.3 μg/kg。

3 結 論

本文建立了測定土壤中61種激素類藥物的QuEChERS/HPLC-MS/MS方法，包括4種雌激素、6種孕激素、5種雄激素、42種糖皮質激素和4種非甾體類激素。在最佳實驗條件下，61種激素的檢出限為0.01～2.3 μg/kg，定量下限為0.03～7.5 μg/kg，平均回收率為62.6%～102%，RSD為1.0%～11%。該方法樣品前處理成本低、簡便快速、靈敏可靠，適合于土壤中激素類藥物殘留的定性、定量分析。