QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定面膜中10種熒光增白劑

張虹艷，邱國玉，吳福祥，許曉輝，王小喬，朱天虹，李晨曦

(蘭州市食品藥品檢驗所,甘肅 蘭州 730050)

熒光增白劑(FWAs)是一種熒光染料，或稱為白色染料，是一類復雜的有機化合物，其特性是激發(fā)入射光線產(chǎn)生熒光，使所染物質獲得類似熒石的效應，使肉眼看到的物質顏色很白，從而起到增白的作用[1]，被廣泛用于造紙、塑料、皮革、紡織、洗滌等行業(yè)[2]。為達到更好的美白效果，一些化妝品生產(chǎn)廠家向面膜中添加FWAs，但如果長期過量接觸熒光增白劑，則存在潛在的致癌性[3]。FWAs通常分為水溶性和脂溶性兩類，其中水溶性的FWAs較易用清水沖洗，而脂溶性的FWAs則易遷移到皮膚的角質層或血液里，導致肌膚排異，產(chǎn)生過敏反應，重則誘發(fā)癌癥[4]。目前，我國《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)中未對FWAs的檢測方法和使用作出明確規(guī)定，也未見相關的國家和行業(yè)標準，僅福建省日用化妝品商會2018年發(fā)布的《4T/FDCA/001-2018化妝品包裝材料中可遷移熒光增白劑的測定》中采用暗箱式紫外分析儀(紫外燈)對化妝品中FWAs進行定性分析，但未對FWAs的種類和含量進行測定。

FWAs的檢測方法主要為光譜法(包括紫外燈照射、紫外分光光度法、熒光分光光度法等[5])和色譜法(包括液相色譜法[6-13]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[14-17]等)。但光譜法只能進行定性或者半定量分析，對于化學結構相似的化合物定性準確度低；液相色譜法只能采用保留時間定性，對組分的分離有較高要求，并且易受雜質干擾，方法靈敏度較低。液相色譜-質譜聯(lián)用法采用保留時間和特征離子對進行定性和定量分析，具有準確度高和靈敏度高的優(yōu)勢。目前，對化妝品中FWAs的檢測研究鮮見報道，僅許江紅等[18]采用SPE-UPLC-MS/MS研究了化妝品中的熒光增白劑。基于此，本研究采用QuEChERS技術結合高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法對面膜中化學結構屬吡唑啉類型的FWAs(C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368)和化學結構屬三嗪氨基二苯乙烯型的FWAs(C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220)進行分析，可為化妝品中FWAs檢驗標準的制定提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

6460三重四極桿液質聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；5810R冷凍離心機(德國艾本德股份公司)；R-12平行溶劑濃縮蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)；VORTEX KB-3渦旋振蕩器(中國海門其林貝爾儀器制造有限公司)，MS105DU電子天平(美國梅特勒公司)。

10種熒光增白劑標準品：C.I.393(純度≥99.7%)、C.I.135(純度≥99.8%)、C.I.185(純度≥98.1%)、C.I.367(純度≥99.9%)、C.I.162(純度≥95%)、C.I.368(純度≥97.9%)購于上海安譜公司；C.I.71(146 μg/mL)、C.I.113(108 μg/mL)、C.I.353(103 μg/mL)、C.I.220(101 μg/mL)為購于福州綠川生物科技有限公司的混合對照品。甲醇、乙腈(色譜純，Merck公司)，PSA、C18(Welch公司)。

1.2 標準溶液配制

準確稱取10種FWAs標準品，配成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液(C.I.367、C.I.393、C.I.368用三氯甲烷溶解，C.I.135、C.I.185、C.I.162、C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220用乙腈溶解)，于-18 ℃冰箱中避光保存。

采用基質加標法配制標準工作曲線溶液，分別移取10種熒光增白劑標準儲備液適量于50 mL棕色容量瓶中，用乙腈配成C.I.393、C.I.368質量濃度為1 μg/mL，C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162質量濃度為100 ng/mL，C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220質量濃度為50 μg/mL的混合標準中間液;稱取與試樣基質相應的陰性樣品，加入混合標準中間液適量，與樣品同步進行提取和凈化。

1.3 樣品前處理

通過紫外燈照射發(fā)現(xiàn)，多數(shù)熒光增白劑吸附于面貼膜的載體(基膜)，故將面貼膜的載體(基膜)作為研究對象，將其剪成5 mm×5 mm大小見方，混合均勻。準確稱取上述樣品2.0 g(精確至0.01 g)置于50 mL具塞比色管中，加入10 mL水和10 mL乙腈，再加入2.0 g NaCl和4.0 g 無水MgSO4，渦旋振蕩5 min，以0 ℃ 12 000 r/min離心5 min，上層清液轉移至已提前放入200 mg C18、600 mg PSA的離心管中，渦旋振蕩5 min，以0 ℃ 12 000 r/min離心5 min，上清液移至玻璃管中，于40 ℃平衡定量濃縮儀中濃縮至近干。殘留物加1.0 mL乙腈渦旋溶解，過0.22 μm濾膜，待高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

1.4 色譜-質譜條件

色譜條件：SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動相:A為10 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.0 min，90% A；1.0～2.0 min，90%～50% A；2.0～4.0 min，50%～10% A；4.0～6.0 min，10% A；6.0～8.0 min，10%～90% A；8.0～10.0 min，90% A。

質譜條件：電噴霧離子(ESI)源；多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測；霧化氣溫度：325 ℃；霧化器流速：6 L/min，噴霧電壓：45 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min。其余質譜參數(shù)見表1。

表1 10種熒光增白劑的CAS號、化學式、保留時間、定性離子信息、碎裂電壓、碰撞能和極性信息Table 1 CAS No.,chemical formula,retention time(RT),quanlitative ions,fragmentor,CE and polarity of the ten FWAs

*quantitative ion(定量離子)

圖1 6種正離子FWAs總離子流圖Fig.1 TIC of six FWAs of positive mode standard solution1.C.I.162;2.C.I.367；3.C.I.393；4.C.I.185；5.C.I.135；6.C.I.368

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

在相同色譜條件下對比安捷倫SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和資生堂MGⅢ(2.0 mm×100 mm,3 μm) 2種色譜柱對10種熒光增白劑的分離效果。結果表明，4種負離子掃描模式下的熒光增白劑(C.I.73、C.I.113、C.I.353、C.I.220)在2種色譜柱上均能實現(xiàn)基線分離，分離度良好;6種正離子掃描模式的熒光增白劑(C.I.162、C.I.367、C.I.393、C.I.185、C.I.135和C.I.368)在MGⅢ色譜柱上不能完全分離，其中C.I.367和C.I.393、C.I.185和C.I.135難以實現(xiàn)基線分離；而SB-C18色譜柱對此6種熒光增白劑均有較好的保留特性(圖1)。

2.2 流動相的優(yōu)化

分別比較了10 mmol/L乙酸銨-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈和水-乙腈3種流動相體系梯度洗脫對10種熒光增白劑響應值和分離度的影響。結果顯示，以0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脫時的響應值較低，以水-乙腈梯度洗脫時，10種熒光增白劑的響應值和分離度均不佳；而采用10 mmol/L乙酸銨-乙腈進行梯度洗脫，10種熒光增白劑的響應值顯著增加，峰形和分離度均得到顯著改善，因此選擇10 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相進行梯度洗脫。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

質譜參數(shù)通過Optimizer軟件對10種熒光增白劑的單標進行自動優(yōu)化，C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368的響應值在正離子模式下顯著高于負離子模式；C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220的響應值在負離子模式下顯著高于正離子模式。采用Scan模式進行一級質譜掃描，找到相應的分子離子峰，以分子離子峰為母離子進行二級質譜掃描，選擇響應值最高的兩個離子分別作為定量和定性離子對。10種熒光增白劑的定性(黑色)、定量(藍色)離子對色譜圖見圖2。

2.4 前處理條件的優(yōu)化

以面貼膜為實驗材料，添加10種熒光增白劑的混合標準溶液(其中C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368的添加水平為10 μg/kg，C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220的添加水平為10 mg/kg)，進行前處理優(yōu)化。

圖3 不同提取溶劑對10種FWAs回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of ten FWAs

2.4.1 提取溶劑的選擇實驗考察了0.5%氨水-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙腈3種常用溶劑的提取效率(圖3)。結果顯示，對于正離子掃描模式下的6種熒光增白劑(C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368)，響應值順序依次為0.1%甲酸-乙腈>乙腈>0.5%氨水-乙腈。而對于負離子掃描模式的4種熒光增白劑(C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220)，響應值高低順序為0.5%氨水-乙腈>乙腈>0.1%甲酸-乙腈。這是因為，0.1%甲酸-乙腈可提高樣品溶液中H+濃度，有助于提高正反應模式下離子化效率，進而使6種正離子掃描模式的熒光增白劑響應值顯著增高；0.5%氨水-乙腈可促進酸性化合物電離，有助于提高負反應模式下離子化效率，進而使負離子掃描模式下的4種熒光增白劑響應值顯著升高。綜合考慮，兼顧本實驗同時進行正、負離子掃描，選擇乙腈為提取溶劑。

2.4.2 鹽加入量由于提取過程中，使用乙腈溶液和水溶液，向樣品中加入無機鹽(NaCl和無水MgSO4)，可以促進分層，進而促使待測物質進入有機相，提高提取效率。實驗考察了NaCl的添加量(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 g)和無水MgSO4的添加量(0.0、1.0、2.0、4.0、6.0 g)對提取效率的影響(圖4)。結果顯示，當NaCl加入量為2.0 g時，鹽析效率最高，10種熒光增白劑的回收率最高；無水MgSO4加入量為4.0 g時，除水效果最好，10種熒光增白劑的回收率最高。因此選擇NaCl和無水MgSO4的加入量分別為2.0、4.0 g。

圖4 不同NaCl(A)和MgSO4(B)用量對10種FWAs回收率的影響Fig.4 Effect of different NaCl(A) and MgSO4(B) amounts on the recoveries of ten FWAs

2.4.3 吸附劑用量實驗分別考察了吸附劑(C18和PSA)用量對凈化效果的影響，C18和PSA總量為800 mg，比較了0 mg C18+800 mg PSA、200 mg C18+600 mg PSA、400 mg C18+400 mg PSA、600 mg C18+200 mg PSA、800 mg C18+0 mg PSA 5種吸附用量的凈化效果。結果顯示，200 mg C18+600 mg PSA凈化時10種熒光增白劑的回收率最優(yōu)。

2.4.4 離心條件的優(yōu)化采用冷凍高速離心機，考察了0、4、10、25 ℃離心溫度下，轉速分別為4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 r/min下的回收率。結果顯示，由于面膜膜材密度小，在溶液中不易沉淀，離心溫度越低、轉速越高，分層效果越好，有助于徹底除雜。因此選擇溫度為0 ℃，轉速為12 000 r/min為樣品離心條件。

2.5 基質效應評價

實驗采用相同濃度的基質標準溶液和溶劑標準溶液分別進樣3針，計算化合物的基質效應(ME=基質標準平均響應值/溶劑標準平均響應值)。若ME=1.0表示不存在基質效應，0.81.5為強基質效應[19]。結果顯示，絕大多數(shù)熒光增白劑為中等基質效應和強基質效應(表2)，這是由于化妝品中含有表面活性劑、天然植物成分、光穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑等多種添加劑，同時含有親水和親脂成分，共流出物較多，對目標分析的離子化有抑制作用。為消除基質效應的影響，確保定量分析的準確性，采用基質匹配標準溶液繪制線性方程。

2.6 線性范圍、檢出限及定量下限

按“1.2”方法配制基質匹配標準溶液，以待測物定量離子對的峰面積(Y)為縱坐標,對應質量濃度(X,ng/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，10種熒光增白劑在一定的質量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r2)均大于0.99，以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，以S/N=10計算定量下限(LOQ)，結果見表2。與液相色譜法測定護膚水中熒光增白劑[4]的文獻相比，C.I.162(正離子掃描模式)的檢出限、定量下限至少降低3個數(shù)量級，C.I.71、C.I.113、C.I.220(負離子掃描模式)的檢出限、定量下限至少降低5倍，表明該方法的靈敏度高、準確性好，更適用于痕量物質的檢測。

表2 10種熒光物質的基質效應、線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限與定量下限Table 2 Matrix effect，linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of 10 FWAs

2.7 回收率與精密度

在陰性面膜中進行3個不同水平的加標回收實驗，于優(yōu)化條件下測定，每個濃度水平平行實驗6次，計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表3。10種熒光增白劑的平均回收率為64.4%～106%，RSD為2.6%～8.5%，表明方法具有較高的準確度和精密度。

表3 面膜中10種FWAs的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs,n=6) of facial mask

圖5 實際樣品FWAs色譜圖
Fig.5 Chromatograms of FWAs in real samples

2.8 實際樣品分析

在優(yōu)化條件下，采用本方法對20批面膜進行測定，共有2批樣品檢出熒光增白劑，1批樣品檢出C.I.367(含量為25.6 μg/kg)，1批樣品檢出C.I.393(含量為15.9 μg/kg)，其樣品色譜圖見圖5。

3 結 論

本研究采用QuEChERS技術結合三重四極桿液質聯(lián)用儀，對面膜中10種熒光增白劑進行分析檢測，可在10 min內(nèi)完成10種熒光增白劑的有效分離。方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、定性定量準確度高等特點，適用于面膜中熒光增白劑的檢測，可為化妝品中熒光增白劑檢驗標準的制定提供依據(jù)。