通過(guò)式固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定水產(chǎn)品中6種麻醉劑殘留

高 平，楊 曦，莫彩娜，陳日檬，曾丹丹，劉喚明，洪鵬志，周 凱，陳營(yíng)壽

(1.湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 湛江 524022；2.廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524094；3.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088 )

在水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品活體運(yùn)輸過(guò)程中，麻醉劑的合理使用可降低養(yǎng)殖動(dòng)物在采卵、采精、采血、運(yùn)輸?shù)炔僮鬟^(guò)程的應(yīng)激反應(yīng)，減少對(duì)其傷害，提高存活率，為漁業(yè)帶來(lái)諸多便利[1-2]。卡因類麻醉劑是目前應(yīng)用最為廣泛的漁用麻醉劑，具有麻醉效果好、操作方便、可迅速麻醉和復(fù)蘇等優(yōu)點(diǎn)[2]，但其安全性存在爭(zhēng)議[3]。目前，世界各國(guó)對(duì)麻醉劑在食用水產(chǎn)品中的應(yīng)用均較為謹(jǐn)慎。美國(guó)、歐盟、加拿大等僅允許3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽(MS-222)用作漁用麻醉劑，并且美國(guó)限定休藥期為21 d[4]，加拿大則規(guī)定休藥期為5 d[1]。挪威批準(zhǔn)苯佐卡因與MS-222為漁用麻醉劑，規(guī)定其休藥期均為21 d[5]。當(dāng)前，我國(guó)對(duì)食用水產(chǎn)品使用麻醉劑的關(guān)注度不夠，在漁用麻醉劑的批準(zhǔn)使用、監(jiān)管方面尚處于空白[3,6]。因此，建立一種同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中多種卡因類麻醉劑的高效、準(zhǔn)確、靈敏的分析方法具有實(shí)際應(yīng)用意義。

目前，水產(chǎn)品中卡因類麻醉劑的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[7-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-16]等。其中，高效液相色譜法的檢出限較高，不能準(zhǔn)確定性；氣相色譜-質(zhì)譜法的樣品前處理復(fù)雜，效率低；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高，抗干擾性強(qiáng)，已應(yīng)用于卡因類麻醉劑的定量與定性確證，但用于水產(chǎn)品中多種麻醉劑同時(shí)測(cè)定的報(bào)道較少。此外，MS-222為三卡因(化學(xué)名為3-氨基苯甲酸乙酯)的甲基磺酸鹽，而三卡因與苯佐卡因(化學(xué)名為4-氨基苯甲酸乙酯)互為同分異構(gòu)體，導(dǎo)致MS-222與苯佐卡因的同時(shí)分離存在一定難度。而已報(bào)道的同時(shí)測(cè)定MS-222和苯佐卡因分析方法中兩者的分離度則有待改進(jìn)[14]。

水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，蛋白質(zhì)、脂肪等含量較高，對(duì)樣品前處理的要求較高?，F(xiàn)有分析方法多采用固相萃取(SPE)技術(shù)凈化樣品[8-13,15-16]，但前處理步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且影響部分目標(biāo)物的回收率。PRiME HLB柱是一種新型的通過(guò)式固相萃取柱，其對(duì)動(dòng)物源性食品中的蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂等具有較強(qiáng)的吸附作用，且操作簡(jiǎn)單快速，對(duì)目標(biāo)組分的吸附少，目前已被應(yīng)用于水產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè)[17-22]，但未見(jiàn)其應(yīng)用于水產(chǎn)品中卡因類麻醉劑殘留測(cè)定的報(bào)道。本文以南美白對(duì)蝦、石斑魚和鱖魚為研究對(duì)象，采用PRiME HLB柱凈化，建立了測(cè)定水產(chǎn)品中普魯卡因等6種卡因類麻醉劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法。該方法操作簡(jiǎn)單，前處理效率高，凈化效果理想，回收率較高，適用于大批量水產(chǎn)品中多種卡因類麻醉劑殘留的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API 3200三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI，美國(guó)AB Sciex公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；ST 16R低速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；AutoEVA-20Plus全自動(dòng)平行濃縮儀(睿科儀器有限公司)；XS-205電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Milli-Q型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；甲酸(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；陶瓷均質(zhì)子(美國(guó)Agilent公司)；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(150 mg/3 mL，美國(guó)Waters公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：鹽酸普魯卡因(CAS:51-05-8，純度≥99%)、利多卡因(CAS:137-58-6，純度≥99%)、鹽酸布比卡因(CAS:14252-80-3，純度≥98%)、鹽酸丁卡因(CAS:136-47-0，純度≥98%)、MS-222(CAS:886-86-2，純度≥97%)、苯佐卡因(CAS:94-09-7，純度≥99%)均購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取適量的6種卡因類麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確移取適量的上述6種單標(biāo)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，其中普魯卡因、利多卡因、布比卡因、丁卡因、MS-222、苯佐卡因的濃度比為4∶1∶2∶1∶2∶2，于4 ℃避光保存。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用空白基質(zhì)提取液稀釋成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入1個(gè)陶瓷均質(zhì)子和2 mL超純水，再加入10 mL 1%甲酸乙腈，振蕩提取10 min后，加入1 g氯化鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂，劇烈振搖1 min，以4 000 r/min離心10 min，上清液待凈化。

取3 mL上述提取液過(guò)Oasis PRiME HLB柱，依靠自然重力流出，收集全部流出液。準(zhǔn)確移取2.0 mL過(guò)柱液，40 ℃水浴氮吹至近干后，準(zhǔn)確加入1.0 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈(95∶5，體積比)，旋渦振蕩1 min溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm微孔濾膜后待分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～2.0 min，5% B；2.0～5.0 min，5%～35% B；5.0～10.0 min，35% B；10.0～15.0 min，35%～5% B；15.0～20.0 min，5% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度：650 ℃；電噴霧電壓：5 000 V；氣簾氣壓力：103 kPa；霧化氣壓力：414 kPa；輔助加熱氣壓力：517 kPa；其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 MRM模式下6種麻醉劑的質(zhì)譜參數(shù)與保留時(shí)間Table 1 Mass parameters and retention times of six anesthetics under MRM mode

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇由于MS-222為三卡因的甲基磺酸鹽，其母體三卡因與苯佐卡因互為同分異構(gòu)體，監(jiān)測(cè)的質(zhì)譜特征離子信息相同，故其在質(zhì)譜上無(wú)法分離，在色譜柱上的有效分離是保證兩者準(zhǔn)確定性與定量的前提。在“1.4.1”的流動(dòng)相梯度洗脫條件下，對(duì)比了ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)、Atlantis T3 C18柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)、ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)和Hypersil Gold C18柱(2.1 mm×150 mm，5 μm) 4種色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果顯示：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱對(duì)6種目標(biāo)物的分離效果較好，色譜峰形尖銳、對(duì)稱；而采用Hypersil Gold C18柱時(shí)，MS-222與苯佐卡因的色譜峰完全重合，利多卡因與布比卡因不能完全分離，且普魯卡因的峰形拖尾；采用ZORBAX SB-C18柱時(shí)，MS-222與苯佐卡因的分離效果較差，普魯卡因的峰形較差；采用Atlantis T3 C18柱時(shí)，普魯卡因的峰形展寬且拖尾。因此，最終選擇ZORBAX Eclipse XDB-C18柱為分離柱。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化考察了乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液4種流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果表明：以乙腈-水或乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，普魯卡因的峰形拖尾，利多卡因和布比卡因的響應(yīng)值偏低；以乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，布比卡因的響應(yīng)值偏低，MS-222與苯佐卡因未能完全分離；而采用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物均能完全分離，峰形尖銳、對(duì)稱，且靈敏度較高。6種麻醉劑的定量離子色譜圖如圖1所示。

2.2 提取溶劑的選擇

通過(guò)式固相萃取法通常以乙腈-水[18]、甲醇-水[19]、酸化乙腈-水[22-23]等作為提取溶劑。由于水產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量高，直接加入強(qiáng)極性有機(jī)溶劑易使其快速變性成團(tuán)，進(jìn)而影響提取效果。故本研究先加入均質(zhì)子和水，將樣品振蕩分散后再加入有機(jī)溶劑，有利于提高提取效率[6]。

實(shí)驗(yàn)考察了先加入2 mL水，再分別加入10 mL的甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈對(duì)6種麻醉劑的提取效率。結(jié)果顯示，采用水和甲醇為提取劑時(shí)，樣品中的蛋白質(zhì)沉淀變性不完全，提取液較渾濁[24]，且目標(biāo)物的回收率不理想(均低于73%)；以水和乙腈為提取劑時(shí)，普魯卡因、利多卡因、布比卡因、苯佐卡因等的回收率為74%～79%；以水和0.1%甲酸乙腈為提取劑時(shí)，普魯卡因的回收率為76%，其他目標(biāo)物的回收率為81%～88%；以水和1%甲酸乙腈為提取劑時(shí)效果最好，6種目標(biāo)物的回收率均超過(guò)80%，故最終選擇水和1%甲酸乙腈為提取溶劑。

2.3 凈化方式的選擇

水產(chǎn)品中卡因類麻醉劑通常采用C18柱[12-13]、HLB柱[8-10]、混合型陽(yáng)離子交換柱(MCX)[11,15]等常規(guī)SPE柱凈化。本研究初期考察了此3種SPE柱對(duì)6種目標(biāo)物加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果表明，采用C18柱(500 mg/3 mL)時(shí)，6種目標(biāo)物的回收率均低于60%；采用HLB柱(200 mg/6 mL)時(shí)，6種目標(biāo)物的回收率為70%～84%；采用MCX柱(60 mg/3 mL)時(shí)，MS-222的回收率低于60%，其他5種目標(biāo)物的回收率為72%～84%。此外，采用上述3種SPE柱凈化時(shí)，需經(jīng)過(guò)溶劑轉(zhuǎn)換、SPE柱活化、淋洗、洗脫、濃縮、復(fù)溶等步驟，操作復(fù)雜，且耗時(shí)長(zhǎng)。

PRiME HLB柱采用通過(guò)式凈化模式，小柱無(wú)需活化、淋洗和洗脫等步驟，提取液直接過(guò)柱，氮吹濃縮后用流動(dòng)相溶解，操作簡(jiǎn)單快速；且可有效去除脂肪、磷脂等水產(chǎn)品中主要干擾雜質(zhì)，降低目標(biāo)物的吸附，保證了回收率[17-18]。在本實(shí)驗(yàn)中，提取液離心后直接過(guò)柱，收集過(guò)柱液后經(jīng)濃縮、流動(dòng)相復(fù)溶過(guò)濾，整個(gè)凈化過(guò)程步驟較少，操作簡(jiǎn)捷，凈化效果較好，6種目標(biāo)物的回收率均大于70%，并且能同時(shí)處理大批量樣品。故最終采用PRiME HLB柱凈化。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的水產(chǎn)品進(jìn)行痕量分析時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響不容忽視[25]。本文采用提取后添加法(即測(cè)定空白基質(zhì)提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液與純?nèi)軇┲邢嗤瑵舛饶繕?biāo)物的響應(yīng)值之比)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME)[26-27]。結(jié)果表明，6種麻醉劑在3種水產(chǎn)品基質(zhì)(南美白對(duì)蝦、石斑魚、鱖魚)中均存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)[27-28]，ME值為0.582～0.851。為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量下限以空白陰性樣品(南美白對(duì)蝦、石斑魚、鱖魚)提取液制備系列濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法進(jìn)行分析。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。以不低于3倍的信噪比(S/N≥3)確定方法檢出限(LOD)，以S/N≥10確定方法定量下限(LOQ)[29]。結(jié)果表明，6種麻醉劑在相應(yīng)范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.993 8～0.998 7，LOD為1.5～6.0 μg/kg，LOQ為5.0～20 μg/kg(見(jiàn)表2)。

表2 不同基質(zhì)中6種麻醉劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of six anesthetics in different matrixes

2.5.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選擇南美白對(duì)蝦、石斑魚、鱖魚的陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每種基質(zhì)分別加標(biāo)1倍、2倍、10倍LOQ 3個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行。計(jì)算平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，3種基質(zhì)中各目標(biāo)物的回收率為76.8%～110%，RSD為4.2%～11%。本方法準(zhǔn)確可靠，精密度好，可滿足水產(chǎn)品中卡因類麻醉劑殘留的分析要求。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)超市和菜市場(chǎng)中隨機(jī)購(gòu)買的20份樣品(包括南美白對(duì)蝦、石斑魚、鱖魚)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有樣品均未檢出待測(cè)麻醉劑。

表3 6種麻醉劑的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Average spiked recoveries(A.R.) and relative standard deviations(RSD) of six anesthetics(n=6)

3 結(jié) 論

本文建立了通過(guò)式固相萃取凈化/HPLC-MS/MS測(cè)定6種卡因類麻醉劑的分析方法。在優(yōu)化條件下,各目標(biāo)物的檢出限為1.5～6.0 μg/kg，定量下限為5.0～20 μg/kg，平均加標(biāo)回收率為76.8%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～11%。該方法前處理操作快速、高效，檢測(cè)成本較低，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏，適用于大批量水產(chǎn)品中上述6種麻醉劑的快速篩查、確認(rèn)與定量。