miR-22靶向NLRP3基因?qū)谛牟〈笫髢?nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的影響研究

樸奇彥，周秀明,李中華，孫 娟

(吉林省前衛(wèi)醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130012)

冠心病臨床中較為常見，是在脂質(zhì)代謝異常影響下引發(fā)的動(dòng)脈內(nèi)膜脂類物質(zhì)堆積，進(jìn)一步引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病變[1,2]。炎癥反應(yīng)作為心臟疾病中重要的作用機(jī)制之一，對(duì)于冠心病的發(fā)生和發(fā)展具有顯著影響[3,4]。近年來，冠心病相關(guān)研究中，對(duì)于microRNA分子調(diào)控作用的關(guān)注顯著提升，miR-22在冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸納入研究的范疇。此次研究選取22只健康SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠進(jìn)行研究，明確miR-22靶向NLRP3基因?qū)谛牟〈笫髢?nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象與方法

22只健康SD雄性大鼠，鼠齡3個(gè)月-4個(gè)月，平均體重是(240.24±60.12)g，入組后大鼠均使用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，正常飲水，在喂養(yǎng)7 d后，采取隨機(jī)數(shù)字表法將入組的大鼠分成研究組和對(duì)照組，每組各11只，對(duì)照組大鼠不進(jìn)行特殊處理，仍舊使用基礎(chǔ)飼料與自來水喂養(yǎng)，研究組大鼠使用高脂飼料喂養(yǎng)，基礎(chǔ)飼料占比94.30%，加入2%的膽固醇、3%的豬油、0.5%的膽酸鈉和0.2%的丙基硫氧嘧啶，另外在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入維生素D3粉劑，在研究實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，在大鼠右下肢注射維生素D3粉劑，注射劑量是3×106U/kg體重，每30 d注射一次。實(shí)驗(yàn)持續(xù)3個(gè)月。入組大鼠的選取和應(yīng)用均符合美國國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南要求，并通過倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

血鈣和血脂的檢測(cè)：采集大鼠腹部主動(dòng)脈血，經(jīng)過5 min的離心處理后，分離血漿，取1 ml進(jìn)行血鈣和血脂檢測(cè)，使用生物化學(xué)分析儀檢測(cè)大鼠的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)和Ca2+的表達(dá)，重復(fù)三次檢驗(yàn)，取平均值。

細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染方法：在無菌環(huán)境下，摘取大鼠的近心端冠狀動(dòng)脈，切下一部分組織進(jìn)行RNA提取，剩余部分放到含雙抗的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行清洗，300*g的頻率離心處理10 min后，去除上清，使用20%FBS DEME-F12培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37℃，濕度適度，空氣環(huán)境5%CO2。在實(shí)施轉(zhuǎn)染的前一天，以2×105/cm2的密度，把待轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到12孔板上，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到60%-80%的范圍時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑盒的說明要求實(shí)施miR-22 mimics轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行相應(yīng)的陰性對(duì)照，形成空白組(未轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、陰性組(轉(zhuǎn)染不相干序列)、miR-22mimic組(轉(zhuǎn)染miR-22過表達(dá)物)、miR-22 inhibi-tor(轉(zhuǎn)染miR-22抑制物)組和miR-22 inhibitor+si NLRP3組(轉(zhuǎn)染miR-22及失活NLRP3基因)，在驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率之后實(shí)施后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。

大鼠心肌組織miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法；NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)采取Western blot檢測(cè)；使用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-18、IL-10、IL-6、IL-1β濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)于研究中觀察和測(cè)量的數(shù)據(jù)適應(yīng)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方法進(jìn)行表達(dá)，并使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)資料使用t進(jìn)行檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血鈣和血脂水平對(duì)比

研究組的TC、TG、LDLC和Ca2+水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。如表1。

表1 大鼠血鈣和血脂水平對(duì)比

2.2 心肌組織miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平及心肌組織NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平對(duì)比

研究組(AS大鼠)的miR-22水平明顯低于對(duì)照組(正常大鼠)，NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平以及NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。如下圖1、圖2。

2.3 各組的miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平及NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平對(duì)比

miR-22mimic組的miR-22明顯高于空白組，NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)，miR-22 inhibitor組和空白組的對(duì)比結(jié)果與之相反(P<0.05)；miR-22mimic組的NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)均明顯低于空白組(P<0.05)，miR-22 inhibitor組明顯高于空白組(P<0.05)。如下圖3、圖4。

2.4 各組的炎癥因子表達(dá)水平對(duì)比

miR-22mimic組的IL-1β、IL-6和IL-18水平明顯低于空白組和陰性組，IL-10明顯高于空白組與陰性組(P<0.05)，miR-22 inhibitor組與空白組及陰性組的炎癥因子水平對(duì)比結(jié)果與之相反(P<0.05)。如下表2。

圖1 心肌組織miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平

圖2 心肌組織NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平

圖3 各組的miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平對(duì)比

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05;與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

圖4 各組的NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平對(duì)比

1.空白對(duì)照組；2.陰性對(duì)照組；3.miR-22 mimic組；4.miR-22 inhibitor組；5.miR-22 inhibitor+siNLRP3組。與空白對(duì)照組比較：*P<0.05;與miR-22 mimic組比較，#P<0.05

3 討論

冠心病是全世界范圍內(nèi)死亡病例及入院治療的一個(gè)主要原因，此次研究結(jié)果表明：miR-22靶向NLRP3基因?qū)谛牟〈笫髢?nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷具有顯著的影響，對(duì)于細(xì)胞凋亡以及炎癥因子的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)保護(hù)作用[5-8]。相較于正常大鼠，冠心病大鼠的血鈣、血脂以及miR-22水平、NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平和NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平均發(fā)生顯著變化。NLRP3炎性體屬于當(dāng)下結(jié)構(gòu)與功能最明確的一種炎性體，能夠在動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中激活，且在冠心病患者主動(dòng)脈中過表達(dá)顯著。NLRP3屬于miR-22的靶向基因，轉(zhuǎn)染miR-22過表達(dá)物后，NLRP3、caspase-1表達(dá)水平明顯下降，轉(zhuǎn)染miR-22抑制物后則顯著上升，提示miR-22靶向NLRP3抑制，能夠使冠心病大鼠心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡得到有效緩解[9-11]。NLRP3炎癥小體激活后，能夠促進(jìn)caspase-1活化，促進(jìn)pro-IL-1β和pro-IL-18成熟及分泌[12,13]。動(dòng)脈硬化時(shí)，磷酸鈣結(jié)晶體能夠激活caspase-1，巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，這與此次研究的結(jié)果具有一致性[14,15]。因此，miR-22靶向NLRP3能夠使相關(guān)炎癥因子的水平得到控制，減緩內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷。綜上所述，miR-22能夠利用顯著的NLRP3基因靶向抑制效果，改善冠心病大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡狀況，且能夠促進(jìn)炎癥因子水平的下降，具有顯著的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

表2 幾組的炎癥因子表達(dá)水平對(duì)比

注：*表示與空白組相比，P<0.05，#表示與陰性組對(duì)比，P<0.05，△表示與miR-22mimic組相比，P<0.05