淋巴單核比、淋巴細(xì)胞亞群在多發(fā)性骨髓瘤患者外周血的表達(dá)分析及與預(yù)后的關(guān)系

程盼盼,王翠玲,張向暉,楊春燕*,竇翠云

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.血液科；2.檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧272000)

骨髓造血微環(huán)境(包括造血干細(xì)胞、T、B、NK淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)以及腫瘤免疫逃逸在多發(fā)性骨髓瘤(MM)的發(fā)病以及疾病進(jìn)展中起重要作用[1,2]。 而淋巴單核細(xì)胞比在惡性腫瘤預(yù)后評(píng)估中有重要作用[3]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)57例多發(fā)性骨髓瘤患者及30例健康志愿者淋巴、單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群(T、B、NK、NKT及CD4/8雙陰性、雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞)，分析多發(fā)性骨髓瘤患者淋巴/單核細(xì)胞比、以及各淋巴細(xì)胞亞群的水平以及與β2-微球蛋白和白蛋白水平的相關(guān)性，探討其在MM預(yù)后的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

以濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科2015年1月-2017年6月住院診治的57例多發(fā)性骨髓瘤患者為研究組，所有診斷均符合張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第3版中的國(guó)內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性33例，女性24例，中位年齡61歲(60.83±9.01，37-77歲)。依據(jù)患者免疫球蛋白進(jìn)行分型，IgG型27例， IgA型25例，IgD1例，輕鏈4例；依據(jù)國(guó)際ISS標(biāo)準(zhǔn)分型，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例；選取30例健康志愿者為對(duì)照，其中男性20例，女性10例，中位年齡60歲(59.27±7.51，36-71歲)。

1.2 主要試劑和儀器

CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC，CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC 以及溶血素為美國(guó)BD公司，流式細(xì)胞儀BD FACS Calibur，全自動(dòng)生化分析儀(羅氏)，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(Sysmex 2100)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

所有觀察對(duì)象均于清晨空腹采取靜脈血，置于EDTA-K2抗凝管，用于全血細(xì)胞分析、淋巴亞群分析及檢測(cè)白蛋白和β2-MG。

1.4 淋巴亞群檢測(cè)

在BD記數(shù)管中準(zhǔn)確加入10 μl四色熒光試劑(CD3/8/45/4，CD3/16+56/45/19)和50 μl全血，充分混勻后置避光室溫孵育30 min 加入2 ml 1×CD3/8/45/4，以及CD3/16+56/45/19血液，充分混勻后室溫避光孵育10 min，300 g離心5 min，2 ml PBS 300 g離心5 min，加入450 μl PBS，24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。獲取及分析采用Cellquest軟件，檢測(cè)時(shí)，每個(gè)樣本測(cè)定管獲取淋巴細(xì)胞數(shù)10000個(gè)，分析淋巴亞群。

免疫比濁法檢測(cè)患者β2-MG，溴甲酚綠法檢測(cè)血清白蛋白水平；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及 血紅蛋白濃度，計(jì)算淋巴單核細(xì)胞比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)， 各參數(shù)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各指標(biāo)與正常對(duì)照相比

與正常對(duì)照相比(見(jiàn)表1)，MM病例組LMR減低，而淋巴細(xì)胞亞群中總T，Ts細(xì)胞較正常對(duì)照增高，其中CD4/8雙陽(yáng)性及雙陰性T淋巴細(xì)胞均較正常對(duì)照組增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B淋巴細(xì)胞較正常減低，雖然NK細(xì)胞MM組較正常組增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 相關(guān)性研究

分析淋巴單核比及各淋巴亞群與白蛋白、β2-MG的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞群及Ts與白蛋白呈正相關(guān)(R=0.293，P=0.027；R=0.257，P=0.005)，CD4/8雙陰性T淋巴細(xì)胞與β2-MG正相關(guān)(R=0.442，P=0.001)，NK細(xì)胞與白蛋白呈負(fù)相關(guān)(R=-0.280，P=0.035)。見(jiàn)圖1-4。

表1 MM組 與正常對(duì)照組淋巴單核比以及淋巴亞群檢測(cè)值

3 討論

淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞均為機(jī)體的免疫細(xì)胞，他們通過(guò)局部免疫抑制和抑制血管生成改變了腫瘤微環(huán)境，低淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)被證實(shí)與不同類型癌癥患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)，而高單核細(xì)胞計(jì)數(shù)是惡性腫瘤患者預(yù)后差的因素之一。淋巴/單核比(LMR)作為腫瘤患者常規(guī)進(jìn)行的、經(jīng)濟(jì)便利的檢測(cè)指標(biāo)，可以早期對(duì)患者的預(yù)后做出一定程度的評(píng)估[3]。 在MM病例中，LMR可作為無(wú)進(jìn)展期生存(PFS)以及總生存期的(OS)檢測(cè)指標(biāo)，Alessandra Romano等人觀察并隨訪了208例MM患者，將3.6作為L(zhǎng)MR的最佳臨界值，發(fā)現(xiàn)初診LMR低于3.6的患者其無(wú)進(jìn)展期生存要低于LMR大于3.6的患者[4]。我們結(jié)果提示MM患者LMR比健康對(duì)照要低，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與白蛋白、微球蛋白相關(guān)，提示LMR與MM疾病的發(fā)病有關(guān)，但與其他指標(biāo)的相關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

圖1CD4/8雙陰性T淋巴細(xì) 圖2T淋巴細(xì)胞與白蛋白 圖3Ts淋巴細(xì)胞與白蛋白圖4NK淋巴細(xì)胞與白蛋胞與β2-微球蛋白相關(guān)性相關(guān)性相關(guān)性白相關(guān)性

B細(xì)胞通過(guò)中和作用、調(diào)理作用、激活補(bǔ)體的方式介導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答。此外，B淋巴細(xì)胞可加工提呈可溶性抗原給T淋巴細(xì)胞，活化的B細(xì)胞還可以分泌各種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。本研究結(jié)果顯示，MM 患者體內(nèi)CD19細(xì)胞的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組。說(shuō)明MM患者機(jī)體存在體液免疫功能的低下和免疫調(diào)節(jié)功能的異常。B細(xì)胞相關(guān)抗原作為CART的靶點(diǎn)在MM治療中有效提示B淋巴細(xì)胞與MM的疾病進(jìn)展相關(guān)[5]。有研究證實(shí)骨髓中單個(gè)核細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1(Blimp1)的表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[6]，提示B淋巴細(xì)胞在MM的疾病進(jìn)展中有作用。但在與白蛋白以及微球蛋白相關(guān)性研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，與其他指標(biāo)的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，MM伴有T淋巴細(xì)胞的表型和功能異常[7]，高鵬等人在對(duì)MM的研究中發(fā)現(xiàn)，NK、調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞以及CD8+T淋巴細(xì)胞的比例增高，B淋巴細(xì)胞、CD4/CD8比值降低[8]。在我們的研究結(jié)果中，除CD8+細(xì)胞增高，B淋巴細(xì)胞和CD4/CD8比值減低外，T淋巴細(xì)胞中CD4/8雙陽(yáng)性及雙陰性T淋巴細(xì)胞比例也增高。CD4/8雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞雖然比例低，對(duì)其研究也少見(jiàn)，但是在抗病毒免疫中發(fā)揮作用，研究指出CD4/8雙陽(yáng)性細(xì)胞含有記憶淋巴細(xì)胞對(duì)潛在高水平病毒感染抗原的特異效應(yīng)器[9]，而CD4/8雙陰性細(xì)胞通過(guò)穿孔素以及細(xì)胞-細(xì)胞間的作用抑制B淋巴細(xì)胞的增殖從而免疫球蛋白和抑制免疫反應(yīng)。我們的研究結(jié)果T淋巴細(xì)胞與Ts細(xì)胞與白蛋白呈正相關(guān)，提示T淋巴細(xì)胞以及Ts細(xì)胞的增高與MM的預(yù)后相關(guān)。CD4/8雙陽(yáng)性以及雙陰性T淋巴細(xì)胞在MM中的作用以及對(duì)其免疫功能的影響也將是我們進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

我們的研究結(jié)果中，NK淋巴細(xì)胞比例增高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是，MM中NK淋巴細(xì)胞活性減低，研究證實(shí)，骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體在對(duì)NK 細(xì)胞功能的抑制中起到了重要作用[10]。而我們的研究中發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞與白蛋白呈負(fù)相關(guān)，也間接證實(shí)了NK淋巴細(xì)胞與MM的疾病進(jìn)展相關(guān)。

綜上所述，LMR以及淋巴亞群在MM中的異常水平提示MM的免疫功能紊亂，而淋巴亞群與MM分期相關(guān)的白蛋白、β2-微球蛋白相關(guān)，提示淋巴亞群的變化與MM的預(yù)后相關(guān)。