14-3-3 zeta在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)研究

王硯硯,樸蓮淑,楊子榮,張 孟,于慶功

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 消化內(nèi)科,遼寧 大連116001)

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,流行病學(xué)調(diào)查顯示,全球范圍內(nèi)其發(fā)病率居常見惡性腫瘤第5位,病死率第3位[1]。因其早期癥狀隱匿,進(jìn)展迅速,惡性程度高,大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期,同時(shí)大多伴有局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,往往預(yù)后不佳。因此,深入探討肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找肝細(xì)胞癌惡性增殖及轉(zhuǎn)移治療干預(yù)靶點(diǎn)已成為近期研究熱點(diǎn)。14-3-3蛋白家族為高度保守性蛋白,參與各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測HCC癌組織和癌旁組織14-3-3 zeta蛋白表達(dá)情況,并對(duì)其與腫瘤臨床病理特征進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2012年1月至2018年12月在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院診治的手術(shù)后肝細(xì)胞肝癌組織標(biāo)本72例,其中男47例,女25例,年齡37-73歲,平均52歲。所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)均參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》的標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前有化療、放療以及免疫治療者；(2)未經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的患者；(3)繼發(fā)性肝癌；(4)合并有其他器官惡性腫瘤；(5)伴有免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 肝組織14-3-3 zeta蛋白檢測應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法,將所有組織標(biāo)本(包含腫瘤組織和癌旁組織)經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片,厚度約為5 μm。將兔抗人14-3-3 zeta 多克隆抗體(Abcam公司,英國)稀釋度為1∶200,作為一抗,染色試劑盒為中杉金橋超敏型PV-9000試劑盒,按試劑說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果的判定兼顧腫瘤陽性細(xì)胞百分率和腫瘤陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度,對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行判定。腫瘤陽性細(xì)胞百分率評(píng)分:0分(<5%)、1分(5%-25%)、2分(26%-50%)、3分(51%-75%)、4分(>75%)。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分(無染色),1分(輕度染色,即淺黃色),2分(中度染色,即棕黃色),3分(強(qiáng)染色,即黃褐色)；免疫組化評(píng)分=腫瘤陽性細(xì)胞百分率×染色強(qiáng)度。對(duì)免疫組化染色進(jìn)行評(píng)分：0-0.5分計(jì)為0分,0.5-1.5分計(jì)為1分,1.5-2.5分計(jì)為2分,>2.5分計(jì)為3分,并且：0分(-),1分(+),2分(++),3分(+++)；(-)和(+)為陰性,(++)和(+++)為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌患者肝組織14-3-3 zeta 蛋白表達(dá)情況經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后,14-3-3 zeta蛋白在HCC組織和癌旁組織中均有表達(dá),且HCC組織(61.1%,44/72)中表達(dá)的陽性率顯著高于癌旁組織(12.5%,9/72),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.51,P=0.00)，如圖1。

注：A為癌組織；B為癌旁組織

2.2 14-3-3 zeta 蛋白表達(dá)陽性率與腫瘤臨床病理特征如表1所顯示,14-3-3 zeta 蛋白在腫瘤組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)、術(shù)前AFP >400 ng/ml、發(fā)生血管浸潤的癌組織中表達(dá)陽性率分別為80.0%、79.5%、82.6%,顯著高于組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)、術(shù)前AFP≤400 ng/ml以及未發(fā)生血管浸潤的癌組織(53.1%、48.5%、55.1%),兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其表達(dá)水平與有無包膜、病灶大小無相關(guān)性。

3 討論

14-3-3蛋白家族是一個(gè)高度保守的酸性多肽家族,其過表達(dá)有助于各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。該蛋白家族中重要成員之一14-3-3 zeta,主要以同源/異源二聚體形式存在,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、有絲分裂、凋亡和侵襲等多個(gè)細(xì)胞過程[2]。既往研究中已經(jīng)被證實(shí)其在食管癌、乳腺癌中表達(dá)顯著升高。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)也通過對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行分析,HCC患者癌組織中14-3-3 zeta蛋白的表達(dá)陽性率明顯上升,顯著高于癌旁肝組織,差異較為明顯,提示14-3-3 zeta蛋白的高表達(dá)均能夠影響到HCC 的發(fā)生過程。有研究者認(rèn)為,14-3-3 zeta在通過激活JNK和p38/MAPK信號(hào)通路調(diào)控HCC細(xì)胞增殖,降低14-3-3 zeta 表達(dá)可以提高化療敏感性[3]。同時(shí),14-3-3 zeta在肝癌細(xì)胞凋亡中也扮演重要角色。過表達(dá)的14-3-3 zeta與ASK1特異位點(diǎn)結(jié)合并相互作用,抑制了ASK1介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。若阻斷二者的特異結(jié)合,則可增強(qiáng)ASK1介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡[4]。

表1 癌組織14-3-3 zeta 蛋白表達(dá)陽性率(%)與腫瘤臨床病理特征分析

唐裕福[5]等研究發(fā)現(xiàn),14-3-3 zeta的表達(dá)與腫瘤大小、衛(wèi)星灶、微血管侵襲、門靜脈癌栓、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、早期復(fù)發(fā)及腫瘤TNM分期等惡性病理特征密切相關(guān),提示14-3-3 zeta可能與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本研究中,對(duì)比不同的臨床病理學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn),癌組織14-3-3 zeta蛋白在組織學(xué)分級(jí)較差、合并血管浸潤以及術(shù)前血清AFP水平較高的HCC患者中表達(dá)陽性率明顯上調(diào)。復(fù)習(xí)相關(guān)研究認(rèn)為：(1)肝癌細(xì)胞中14-3-3 zeta上調(diào)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子snail和tiwst的表達(dá),抑制了E-cadherin的表達(dá),即通過調(diào)控上皮間質(zhì)化(EMT)的進(jìn)程來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,與腫瘤分化程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)[6]。(2)14-3-3 zeta 表達(dá)增加與術(shù)前血清AFP升高在輔助診斷原發(fā)性肝癌中具有一致性,提示14-3-3 zeta將可能成為未來早期診斷和篩查肝細(xì)胞性肝癌的新生標(biāo)志物[7]。(3)在腫瘤細(xì)胞的侵襲過程中,腫瘤周圍基質(zhì)的降解由金屬基質(zhì)酶(MMPs)調(diào)控,血管的生成則由血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)調(diào)控,而14-3-3 zeta 調(diào)控著二者的表達(dá)。但本研究并未發(fā)現(xiàn) 14-3-3 zeta蛋白的表達(dá)與肝癌組織包膜浸潤及腫瘤病灶大小的關(guān)系,這與王愷等的研究結(jié)果不一致,分析其原因可能14-3-3 zeta主要參與肝癌免疫反應(yīng)有關(guān)[8,9]。

14-3-3蛋白可與多種蛋白結(jié)合,參與了細(xì)胞內(nèi)廣泛的生物學(xué)事件調(diào)控過程,探索14-3-3 zeta在惡性腫瘤中的凋亡調(diào)控作用,有望為肝細(xì)胞癌的生物學(xué)治療提供新的思路[10]。