凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法檢測飼料粗蛋白質(zhì)含量的比較

梁世岳， 李?；?， 陳龍賓， 陳麗麗， 李玉鵬， 楊鴻雁*

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

粗蛋白質(zhì)是飼料重要的營養(yǎng)成分之一，是畜禽生長發(fā)育必需的營養(yǎng)物質(zhì)。蛋白質(zhì)一般由碳、氫、氧、氮四種元素構(gòu)成，其中氮是蛋白質(zhì)中含量最穩(wěn)定的元素，平均含量為16%，所以測定蛋白質(zhì)含量通常只測定氮元素含量（張妍妍，2013）。畜牧行業(yè)采用由飼料中含有的氮元素含量乘以蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化系數(shù)（常以6.25來表示）所得到的數(shù)據(jù)來推算飼料中蛋白質(zhì)的含量，即通常所說的粗蛋白質(zhì)。因此，飼料中粗蛋白質(zhì)的檢測本質(zhì)就是飼料中氮元素的檢測。目前，我國飼料粗蛋白質(zhì)的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法主要采用凱氏定氮法（李仲玉和杜娟，2017）。

凱氏定氮法是Kjeldahl于1883年提出的定氮方法（張清建，1995）。這種方法精確可靠，具有良好的精密度和重復(fù)性，設(shè)備成本較低，我國多采用此法。但是該方法操作步驟繁瑣,消耗時(shí)間長，對操作人員要求較高，測定結(jié)果受人為因素影響較大，操作中使用大量腐蝕性強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，有一定的危險(xiǎn)性，并且檢測過程會(huì)產(chǎn)生有毒有害氣體，既危害人體健康又造成環(huán)境污染。杜馬斯燃燒定氮法通過高溫燃燒將氮元素轉(zhuǎn)化為氮氧化合物進(jìn)行定量，無需任何化學(xué)試劑，儀器自動(dòng)進(jìn)樣和計(jì)算結(jié)果，是一種快速、低成本、自動(dòng)化高的定氮方法。本實(shí)驗(yàn)采用凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法同時(shí)測定飼料樣品，對檢測方法和檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，以期找到一種能準(zhǔn)確、簡捷、快速、無污染測定飼料粗蛋白質(zhì)含量的有效方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1.1 凱氏定氮法 催化劑條件下用濃硫酸高溫消煮，將飼料中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)換為銨態(tài)氮并與硫酸結(jié)合為硫酸銨，通過強(qiáng)堿蒸餾來確定全氮含量（許超，2018）。 凱氏定氮法是一個(gè)氧化還原反應(yīng)，把低價(jià)氮氧化并轉(zhuǎn)為氨鹽來測定，但不能把高價(jià)氮還原為氨鹽的形式，所以不能測出物質(zhì)中所有價(jià)態(tài)的氮含量（周航等，2009），比如硝基氮和亞硝基氮，導(dǎo)致某些樣品的檢測結(jié)果偏低。

1.1.2 杜馬斯燃燒定氮法 樣品在900～1200℃純氧高溫下燃燒，產(chǎn)生的混合氣體中氮氧化物被全部還原成分子氮，被熱導(dǎo)檢測器檢測（范志影和劉慶生，2007），經(jīng)獨(dú)立校正后自動(dòng)計(jì)算出來，乘以相應(yīng)的轉(zhuǎn)換系數(shù)即為粗蛋白質(zhì)含量，每個(gè)樣品4～6 min即可完成（趙玉富，2013）。杜馬斯燃燒法能將樣品所含的有機(jī)氮和無機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化成氮的氧化物后被還原劑還原成氮?dú)膺M(jìn)行測定 （朱國霞和哈玲津，2017）。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品 從河北和天津的飼料加工廠采集包括玉米、小麥、次粉、小麥麩、玉米DDGS、菜籽粕、大豆粕、苜蓿和魚粉等12份飼料原料作為檢測樣品，隨機(jī)編號樣品1～樣品12，用FOSS旋風(fēng)磨粉碎至過40目篩，得到樣品量100 g左右，置于密封袋中備用。

1.3 儀器與設(shè)備 全自動(dòng)凱氏定氮儀 （型號為FOSS 2300）；消化爐（型號為 FOSS 2040）；旋風(fēng)磨（型號為CT 410），購自丹麥FOSS公司；杜馬斯燃燒定氮儀（型號為Rapid N），購自德國Elementar公司；分析天平 （型號為AE 100），購自瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.4 試劑與耗材 混合催化劑 (每片含3.5 g K2SO4及 0.4 g CuSO4·5H2O)， 購自丹麥 FOSS 公司；硫酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、硼酸（AR）、鹽酸（AR）、甲基紅（AR）、溴甲酚綠（AR），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氮?dú)?≥99.99%)、氧氣(≥99.999%)、氦氣(≥99.999%)，購自天津泰亞氣體銷售有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法同時(shí)對實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行粗蛋白質(zhì)含量測定，每個(gè)樣品分別做2個(gè)平行測定，粗蛋白質(zhì)含量在25%以上時(shí)，允許相對偏差為1%；粗蛋白質(zhì)含量在10%～25%時(shí)，允許相對偏差為2%；粗蛋白質(zhì)含量在10%以下時(shí)，允許相對偏差為3%。否則，需重新稱樣測定，直至平行樣結(jié)果相對偏差符合要求為止，取平均值為測定結(jié)果。凱氏定氮法：每次消煮10個(gè)樣品，消煮時(shí)間約4 h，蒸餾時(shí)間約150 m，分2次完成。杜馬斯燃燒定氮法：每個(gè)樣品需4～6 min，一次性完成檢測，共需時(shí)間約2 h。

1.6 實(shí)驗(yàn)步驟

1.6.1 凱氏定氮法 稱取樣品0.5 g左右，精確至0.0001 g，依據(jù)GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》操作，全自動(dòng)分析儀自動(dòng)輸出檢測結(jié)果。

1.6.2 杜馬斯燃燒定氮法 稱取樣品0.25 g左右，精確至0.0001 g，置于錫箔紙中，擠出空氣、壓實(shí)，緊密包裹后置于自動(dòng)落樣器，儀器自動(dòng)進(jìn)樣檢測并輸出結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2007對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對樣本T檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結(jié)果由表1可知，樣本粗蛋白質(zhì)含量為7.88%～69.46%，跨越區(qū)間較大，代表性較強(qiáng)。兩組檢測結(jié)果的相對偏差基本都在2%以下，標(biāo)準(zhǔn)差都在0.60%以下，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》GB/T 6432-1994（國家技術(shù)監(jiān)督局，1994）的要求。

2.2 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 由表2可知，兩組數(shù)據(jù)的差值為-0.86% ～0.29%、比值為98.76% ～101.10%，檢測結(jié)果基本一致；兩組數(shù)據(jù)經(jīng)配對樣本t檢驗(yàn)，P＞0.05，表明凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法對樣品的測定結(jié)果無明顯差異。

表1 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結(jié)果 %

表2 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒定氮法檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析%

2.3 凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法的比較

2.3.1 樣品要求比較 凱氏定氮法可以測定所有形態(tài)的樣品，固態(tài)樣品要求粉碎至過40目篩即可。杜馬斯燃燒法不能直接檢測液體樣品，對于復(fù)雜樣品分析難度較大，要求樣品是均勻粉末，由于稱樣量較小，樣品細(xì)度要求較高，一般過100目篩，以利于所稱樣品具有代表性。

2.3.2 稱樣量比較 凱氏定氮法稱樣量，一般以0.4～ 0.5 g為宜；杜馬斯燃燒法稱樣量為0.25 g以下，對于密度小體積較大的樣品，稱樣量應(yīng)低于0.2 g，以確保其錫箔紙包，能順利進(jìn)入樣品孔。凱氏定氮法對樣品的稱樣量要求相對寬松，而杜馬斯燃燒法要求較嚴(yán)格，由于進(jìn)樣孔徑的限制，要求稱樣量與進(jìn)樣孔徑相匹配，以免檢測失敗。

2.3.3 檢測時(shí)間比較 凱氏定氮法稱樣后需要消解和蒸餾步驟，一次可消解樣品10個(gè)左右，檢測過程需1～2 d；杜馬斯燃燒法稱樣后可直接進(jìn)樣即時(shí)測定，每個(gè)樣品只需4～6 min就能得到檢測結(jié)果。

2.3.4 環(huán)境污染和安全性比較 凱氏定氮法檢測過程中使用濃酸、濃堿，產(chǎn)生大量含有化學(xué)污染物的廢氣、廢液，對人體和生態(tài)環(huán)境危害較大。杜馬斯燃燒法不使用化學(xué)藥品，且不會(huì)產(chǎn)生有毒有害的廢液、廢氣，安全性較高。

2.3.5 檢測人員比較 凱氏定氮法檢測人員需經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)和系統(tǒng)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)室檢測知識，熟練掌握操作技能，整個(gè)檢測過程需檢測人員認(rèn)真操作完成。杜馬斯燃燒法無需人員在場，儀器自動(dòng)完成檢測過程。

2.3.6 檢測成本比較 凱氏定氮法使用大量化學(xué)試劑及玻璃器具，檢測過程需要保持冷凝水供給，電能和水源耗費(fèi)較多。杜馬斯燃燒法不需化學(xué)試劑及器具，不需冷凝水，幾分鐘即可完成檢測，耗電少，檢測成本較低。

2.3.7 測定結(jié)果比較 表1和表2說明兩方法均具備良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，且兩種檢測方法的檢測結(jié)果基本一致，經(jīng)配對樣本t檢驗(yàn)，P＞0.05，說明兩種檢測方法的檢測結(jié)果差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法測定結(jié)果的相對偏差都在2%以下；差值為-0.86%～0.29%；比值為98.76%～101.10%；經(jīng)配對樣本t檢驗(yàn)，P＞0.05；說明兩種方法均具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性且檢測結(jié)果差異不顯著，均能正確檢測樣品的粗蛋白質(zhì)含量。

凱氏定氮法所用儀器價(jià)格低廉，即使在很小的實(shí)驗(yàn)室也可以用簡單的凱氏定氮裝置實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的測定，但檢測時(shí)間長，檢測成本高，工作量大，不適合大量樣品的檢測，檢測效率較低；檢測過程中常有試劑揮發(fā)，易對檢測人員身體造成傷害和環(huán)境污染。杜馬斯燃燒定氮法操作簡易方便，自動(dòng)化程度高，大大縮短了檢測時(shí)間，無需化學(xué)試劑和冷凝水，降低了檢測成本，檢測效率較高；由于整個(gè)檢測過程沒有有毒有害物質(zhì)產(chǎn)生，操作人員不用擔(dān)心化學(xué)試劑對身體的傷害，也減少了環(huán)境污染，安全性較高。因此，杜馬斯燃燒定氮法符合當(dāng)前社會(huì)的需要，是值得推廣的一種粗蛋白質(zhì)檢測方法。

由于實(shí)驗(yàn)原理不同，凱氏定氮法只能測出部分硝態(tài)氮，對于含有硝酸鹽的樣品，測定結(jié)果影響較大，而杜馬斯燃燒法能夠?qū)悠分械牡赝耆珯z測出來。以魚粉樣品為例，凱氏定氮法的測定結(jié)果比杜馬斯燃燒法低約1個(gè)百分點(diǎn)，杜馬斯燃燒法對樣品要求較高，不能檢測液態(tài)樣品，對于復(fù)雜樣品的分析效果欠佳，具有一定的局限性。杜馬斯定氮儀由于其較高的技術(shù)含量，儀器價(jià)格比較昂貴，從而限制了其在小型飼料廠的推廣應(yīng)用。