ELISA與HPLC-MS對飼用玉米中2種霉菌毒素的比較分析

鐘興文， 王炳彥， 陳 琛， 楊旭艷 ， 楊秀娟，陳 瑩， 孫照程， 華雪妃， 孔凡虎， 章雨竹， 陶琳麗*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南昆明 650201；2.牟定縣新橋鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，云南楚雄675501；3.大理白族自治州動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南大理 671000）

赤霉烯酮（ZEA）是一種非類固醇的具有雌激素效應(yīng)的鐮刀菌毒素，主要污染玉米、小麥、大麥等谷物作物，毒素可作用于畜禽的生殖系統(tǒng)，引起雌性動物產(chǎn)生雌激素過多綜合征和嚴(yán)重的生殖道癥狀及不孕癥，同時會對動物機體產(chǎn)生遺傳毒性、免疫毒性、細胞毒性和致腫瘤毒性（祭芳等，2019；姜淑貞等，2011）。T-2毒素也是污染我國飼料原料的主要霉菌毒素之一，被列為最危險的天然污染源之一，主要表現(xiàn)為基因毒性、細胞毒性和血液毒性，能夠通過食物鏈的傳遞和生物體的蓄積作用，污染谷物及其制品，進而對畜禽及其產(chǎn)品的安全性甚至人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅（薛山等，2013）。大量研究表明，ZEA和T-2毒素在我國玉米中有很高的污染率，且這兩種毒素對畜禽生產(chǎn)和人類自身都有巨大的危害（杜妮，2018；梁琛等，2017）。因此，加強對玉米中ZEA和T-2毒素的監(jiān)測有利于保障生產(chǎn)者和消費者的切身利益，對飼料工業(yè)、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展也有著重大意義。

目前霉菌毒素的檢測方法主要有生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和化學(xué)儀器分析法等，根據(jù)檢測效率的快慢，又可分為快速方法和確認(rèn)方法（Agag，2004）?？焖俸Y選霉菌毒素的方法以酶聯(lián)免疫（ELISA）法較為常用，該法具有操作簡單方便、成本較低、檢測快速等優(yōu)點，適合大批量樣品的快速檢測，但因所需抗原、抗體靈敏度較高，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。而確認(rèn)方法主要基于色譜法，如氣相色譜法（Tarter等，1991）、高效液相色譜法（梁雄宇等，2011）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法等 （趙孔祥等，2011；Beltran等，2009）。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法集高效分離和多組分定性和定量檢測于一體，是理想的檢測方法，逐漸成為霉菌毒素檢測的主流方向，但對檢驗人員的技術(shù)要求較高 （王瑞國等，2015）?；跈z測霉菌毒素的重要性，本研究采用ELISA和HPLC-MS對飼用玉米中的ZEA和T-2毒素進行檢測，旨在比較兩種方法對飼用玉米中ZEA和T-2毒素的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備 在多家飼料廠采集飼用玉米30份。采集方法嚴(yán)格按照 《飼料采樣法》（GB/T14699.1-2005）的要求，用四分法縮減取200 g，用粉碎機粉碎后過40目篩，混勻裝入自封袋中備用，樣品在測定前于-20℃冰箱中密封保存。

1.2 主要儀器 ST-360酶標(biāo)儀 （上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）；TSQ QUANTIVA高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀 （Thermo Scientific）；300 g搖擺式高速萬能粉碎機 （溫嶺市林大機械有限公司）；SHA-B恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司）；H2050R高速冷凍離心機 （湘儀離心機有限公司）。

1.3 主要試劑 甲醇、乙酸、甲酸、乙腈，均為色譜純，購自天津市光復(fù)有限公司；氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、吐溫-20、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品和T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；黃曲霉毒素B1/玉米赤霉烯酮/T-2毒素三合一免疫親和柱，購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒，購自北京龍科方舟生物工程有限公司。

1.4 酶聯(lián)免疫法 ZEA預(yù)處理：稱取（5±0.1）g制備的玉米樣品于50 mL離心管中，加入25 mL 70%甲醇溶液，在恒溫振蕩器（200～300 r/min）上充分振蕩提取3 min，靜置后取上清液，4000 r/min離心5 min，向900μL ZEA樣品稀釋液中加入離心后的上清液100μL，混勻待檢；T-2預(yù)處理：同ZEA處理，最后一步改為向950μL的T-2毒素樣品稀釋液中加入離心后的上清液50μL，混勻待檢。將ZEA和T-2毒素的待檢樣品按照各自的試劑盒方法進行操作，最后在酶標(biāo)儀450 nm/630 nm雙波長下檢測其吸光度，然后根據(jù)樣品的百分吸光度計算ZEA和T-2毒素的含量。ELISA法對ZEA和T-2毒素的檢出限分別為25μg/kg和 20μg/kg。

1.5 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法 參考NY/T 2071-2011《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進行測定，其過程是利用試樣中的霉菌毒素經(jīng)乙腈溶液提取，正己烷脫脂及霉菌毒素多功能凈化柱凈化后，氮氣吹干，甲酸乙腈溶液復(fù)溶，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，采用色譜保留時間和質(zhì)譜碎片及其離子豐度比定性，外標(biāo)法定量。HPLCMS法對ZEA和T-2毒素的檢出限分別為5μg/kg和 1μg/kg。

1.5.1 樣品預(yù)處理 樣品提?。悍Q?。?±0.01）g玉米樣品于50 mL離心管中，加入25 mL 80%乙腈-水溶液（乙腈∶水=80∶20）提取，在恒溫振蕩器（250 r/min）上劇烈振蕩 20 min，然后 4000 r/min離心5 min，取5 mL離心后的上清液加入35 mL稀釋液稀釋，混勻，取20 mL濾液過柱。樣品凈化：取出接近室溫的免疫親和柱，將20 mL注射器的下端直接穿透親和柱上方的塞子，完成注射器筒與親和柱的連接，去掉親和柱下方堵頭，將其插在固相萃取裝置的架子上進行固定，完成親和柱與固相萃取裝置的連接，在注射器針筒內(nèi)裝上20 mL濾液，調(diào)節(jié)固相萃取開關(guān)，使濾液以1～2滴/s的速度流出，待液體排干后，先用10 mL洗滌液（0.1%Tween-20水溶液）洗滌一次，排干；再用10 mL超純水洗滌一次，流速為2～3滴/s；待液體排干后，關(guān)閉固相萃取開關(guān)。樣品洗脫：在親和柱內(nèi)加入 2 mL洗脫液（甲醇：乙酸=98：2），靜置 3 min后，以1滴/秒速度洗脫，用10 mL的玻璃試管收集洗脫液，調(diào)節(jié)氮吹儀的參數(shù)，控制適宜的氮氣流速，在50℃的氮氣下吹干洗脫液，用1 mL甲酸乙腈（1∶1）溶液復(fù)溶，再用渦旋振蕩器振蕩5～10 min使霉菌毒素和復(fù)溶液充分溶解，用1 mL注射針筒吸出溶解液，過0.22μm的有機濾膜，裝瓶上機。

1.5.2 液相色譜條件 色譜柱：C18柱 （長度50 mm，內(nèi)徑1.9μm）；流動相：0.1%的甲酸溶液和1∶1的甲醇乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：33℃；進樣量：5μL；質(zhì)譜檢測器。流動相、流速及洗脫條件如表1和表2所示。

表1 ESI+源梯度洗脫條件

表2 ESI-源梯度洗脫條件

1.5.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描模式和負離子掃描模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細管電壓，模式4000 V，負模式3500 V；干燥氣溫度：350℃；霧化氣壓力：40 psi；脫溶劑氣、錐孔氣均為高純氮氣；碰撞氣為高純氬氣。

1.6 限量標(biāo)準(zhǔn) 玉米赤霉烯酮（ZEA）和T-2毒素均參照 《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB13078-2017），ZEA≤500 μg/kg；T-2≤ 500 μg/kg。

1.7 數(shù)據(jù)處理 所有實驗數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel進行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米赤霉烯酮的檢出結(jié)果 由表3可知，使用ELISA法和HPLC-MS法對飼用玉米中ZEA的檢出率均為100%，且兩種方法檢出結(jié)果最高的均是18號玉米樣品，檢出值分別為918.80μg/kg和345.01μg/kg。ELISA法檢出結(jié)果最低的是11號玉米樣品，含量為28.07μg/kg，對應(yīng)HPLC-MS法檢出值為12.97μg/kg。而HPLC-MS法檢出結(jié)果最低的是17號玉米樣品，含量為5.00μg/kg，對應(yīng)的ELISA法檢出值卻為99.47μg/kg，遠高于HPLC-MS法。即HPLC-MS法測定ZEA的最高、最低含量均低于ELISA法測定的結(jié)果。根據(jù)2017版的《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中ZEA的限量標(biāo)準(zhǔn)（ZEA≤500μg/kg），ELISA法檢測超標(biāo)數(shù)量有 3個，而HPLC-MS法則無超標(biāo)樣品。兩種檢測方法對ZEA的檢出結(jié)果相差最大的是13號玉米樣品，相差值為810.06μg/kg；檢出結(jié)果相差最小的是8號玉米樣品，相差值為1.61μg/kg，其他玉米樣品的檢測結(jié)果均有不同程度差異。實驗結(jié)果表明，1號、15號、20號樣品的檢測結(jié)果是HPLC-MS法高于ELISA法，而其他玉米樣品的檢測結(jié)果都是ELISA法高于HPLC-MS法。

表3 玉米赤霉烯酮的檢測結(jié)果 μg/kg

2.2 T-2毒素的檢出結(jié)果 由表4可知，ELISA法對飼用玉米中T-2毒素的檢出率為83.33%。HPLC-MS法檢出11號玉米樣品的T-2毒素含量為0.48μg/kg，低于HPLC-MS法的檢出限，相當(dāng)于未檢出，并且也遠小于對應(yīng)的ELISA法檢出的結(jié)果62μg/kg，而其余的玉米樣品則都沒被檢測到。使用ELISA法檢測飼用玉米樣品中T-2毒素含量最高是1號樣品，含量為124.6μg/kg，對應(yīng)的HPLC-MS法卻未檢出。兩種檢測方法下，13號、14號、21號、23號、24號玉米樣品未檢出T-2毒素。根據(jù)2017版的《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中T-2的限量標(biāo)準(zhǔn) （T-2≤500μg/kg），發(fā)現(xiàn)ELISA法和HPLC-MS法對飼用玉米中T-2毒素含量的檢測結(jié)果顯示均未超標(biāo)。結(jié)果表明，ELISA法對飼用玉米中T-2毒素的檢出結(jié)果均大于HPLC-MS法，且ELISA法的檢測結(jié)果也相對較低。

3 討論

本研究中采用ELISA法和HPLC-MS法檢測ZEA的檢出率均為100%，而蔣玉寒（2015）、楊曉飛（2007）、王若軍（2003）等研究不同地區(qū)的玉米中ZEA也是100%檢出，這說明了我國大部分地區(qū)的玉米普遍被ZEA污染。李玲（2017）檢測玉米副產(chǎn)物中ZEA的情況與本研究結(jié)果一致，侯真真（2018）在干酒槽、蛋白粉、高粱等雞飼料原料中也有不同程度的檢出ZEA，證實ZEA對谷物類作物污染廣泛，且在實際生產(chǎn)中難以消除，人們應(yīng)該加強對ZEA的監(jiān)測。ELISA法檢測玉米樣品中T-2毒素時的檢出率為83.33%，但檢出含量相對較低，無超標(biāo)樣品，而HPLC-MS法的檢出率幾乎為零。

在本實驗中，兩種方法檢測玉米中ZEA、T-2毒素時得到的結(jié)果都存在差異，ELISA法檢測出的結(jié)果普遍高于HPLC-MS法檢測的結(jié)果。影響ELISA法測定結(jié)果的原因有以下幾個方面：（1）樣品預(yù)處理可直接影響霉菌毒素的分析靈敏度和準(zhǔn)確度，選擇合適的溶劑才能確保最大程度的提取到霉菌毒素。陳建偉（2012）以玉米為試材發(fā)現(xiàn)，甲醇濃度對ELISA測定結(jié)果影響最為顯著，其次是提取溶液體積和提取時間以及溫度。（2）ELISA法不能把玉米樣品中的脂肪、重金屬離子除去，而重金屬離子的存在會破壞酶的活性，使酶底物加入后顯色偏淺，易出現(xiàn)假陽性；或是脂肪吸附在包被抗體孔中阻礙了樣品液抗原與抗體的結(jié)和，也會造成假陽性（乙小娟等，2000）。（3）由于提取液甲醇易揮發(fā)，制成樣品液時不易控制其pH，樣品液的pH過高、過低都會影響檢測結(jié)果。陳玲（2006）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品提取液pH低于5時，酶標(biāo)抗原中酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化并丟失其大部分活性，導(dǎo)致顯色反應(yīng)時顏色偏淺，使結(jié)果出現(xiàn)假陽性。玉米樣品液的pH應(yīng)在6～8為宜，若偏離此范圍要用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。（4）霉菌毒素之間有共同污染的現(xiàn)象（周建川等，2018；龔阿瓊，2017）。本實驗檢測的ZEA和T-2毒素可能與其他毒素也有交叉反應(yīng)的現(xiàn)象。（5）霉菌毒素在不同試劑盒方法中的預(yù)處理方法、數(shù)據(jù)處理方式以及毒素的回收率、檢出限及檢測范圍等的差異都會對測定結(jié)果造成影響。HPLC-MS法是較為理想的檢測，不存在交叉反應(yīng)和假陽性的問題，已被廣泛應(yīng)用，是檢測霉菌毒素方法中較為權(quán)威的 （王瑞國，2015）。但對實驗員的操作要求較高，若在前處理過程中操作不當(dāng)，如毒素洗脫不完全、氮氣吹的過多，使樣品中霉菌毒素含量減少，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低；還有HPLC-MS法的檢測時間較長，可能會使待測毒素發(fā)生氧化，影響測定結(jié)果。

表4 T-2毒素的結(jié)果μg/kg

綜上所述，玉米中的霉菌毒素用ELISA法檢測的結(jié)果普遍高于HPLC-MS法，HPLC-MS法則是結(jié)合了液相色譜的高分離度、高靈敏性和質(zhì)譜檢測器的通用性、可知分子結(jié)構(gòu)、選擇性好等優(yōu)點，檢測玉米中霉菌毒素時測定結(jié)果較為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。因此，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，相關(guān)人員可根據(jù)不同的檢測目的選擇不同的檢測方法，或者是先采用ELISA法進行初篩，樣品呈陽性之后，再采用HPLC-MS法進行分析驗證，這樣得到的結(jié)果較為可靠又有實際意義。

4 結(jié)論

本實驗采用兩種檢測方法對飼用玉米中ZEA和T-2毒素的檢測結(jié)果顯示，ELISA法檢測的結(jié)果普遍高于HPLC-MS法。但根據(jù)兩種檢測方法的優(yōu)缺點，檢測飼用玉米中的ZEA和T-2毒素時，適合用ELISA法初篩，檢測結(jié)果呈陽性之后，再用HPLC-MS法進行精確定量。