天麻超微粉細(xì)胞破壁率的測定

龍海林 蔡鴻飛 袁誠 李康強 楊陽 李秋林 李海波 許文東

[摘要]目的 探討天麻超微粉細(xì)胞破壁率的測定方法，評價超微粉碎后天麻粉末的細(xì)胞破碎程度。方法 采用顯微制片細(xì)胞計數(shù)法，以天麻粉末中的薄壁細(xì)胞為評價指標(biāo)，確定天麻粉末質(zhì)量與薄壁細(xì)胞數(shù)目的線性關(guān)系，通過對比天麻常規(guī)粉末與超微粉薄壁細(xì)胞的數(shù)量，計算天麻超微粉的細(xì)胞破壁率。結(jié)果 天麻粉末中薄壁細(xì)胞可清晰觀察并計數(shù)，薄壁細(xì)胞數(shù)目與粉末的質(zhì)量成正相關(guān)，在3.8124～22.8744 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，天麻粉末經(jīng)超微粉碎后細(xì)胞已完全破碎，超微粉的細(xì)胞破壁率可達(dá)99%以上。結(jié)論 天麻粉末顯微制片細(xì)胞計數(shù)法測定天麻超微粉細(xì)胞破壁率具有可行性和科學(xué)性，能夠為評價超微粉的細(xì)胞破碎程度提供參考和依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]天麻;超微粉碎;薄壁細(xì)胞;顯微計數(shù);細(xì)胞破壁率

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）7（c）-0020-04

[Abstract] Objective To explore the determining method of cell wall-broken rate of Gastrodia elata micropowde， and to evaluate the degree of cell breakage of Gastrodia elata micropowde. Methods The parenchyma cells in Gastrodia elata powder were taken as the evaluation index， the linear relationship between the quality of Gastrodia elata powder and the number of parenchyma cells was determined by microscopic cell counting method. By comparing the number of parenchyma cells of Gastrodia elata conventional powder with that of ultrafine powder， the cell wall-broken rate of ultrafine powder of Gastrodia elata was calculated. Results The parenchyma cells in Gastrodia elata powder could be clearly observed and counted， the number of parenchyma cells was positively correlated with the quality of Gastrodia elata powder， and the linear relationship was good in the range of 3.8124-22.8744 mg. The cells of Gastrodia elata powder have been completely broken after ultrafine comminution， the wall-broken rate of Gastrodia elata micropowder was over 99%. Conclusion It is feasible and scientific to determine the wall-broken rate of Gastrodia elata micropowder by microscopic cell counting method， and provide reference and basis for evaluating the degree of cell breakage of ultrafine powder.

[Key words] Gastrodia elata; Superfine pulverizing technique; Parenchyma cell; Microscopic count; Cell wall-broken rate

天麻始記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，被列為上品，原名“赤箭”[1]，屬蘭科多年生草本植物的地下干燥根莖[2]，因莖赤如箭桿而得名，主產(chǎn)于陜西、云南、貴州等地，其主要成分為天麻素、天麻苷元等酚類化合物及甾醇、核苷、有機酸、多糖等[3]，其中天麻素和天麻苷元為天麻中主要的藥用活性成分[4]。天麻味甘辛，性平，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、平肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)之功，主治急慢性驚風(fēng)、抽搐拘攣、破傷風(fēng)、頭痛眩暈、半身不遂、肢體麻木、風(fēng)濕痹痛等癥[5]，臨床應(yīng)用非常廣泛。

超微粉碎技術(shù)是一門多學(xué)科交匯的現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，應(yīng)用于較多領(lǐng)域，如材料、化工、醫(yī)藥等行業(yè)[6]。中藥材超微粉碎技術(shù)是在近代工業(yè)技術(shù)與中醫(yī)藥結(jié)合基礎(chǔ)上發(fā)展起來的“民生科技”，已有研究顯示超微粉碎技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[7]，中藥材超微粉碎技術(shù)可以使中藥材粉末更加細(xì)化。目前，我國可供中醫(yī)入藥的植物、動物已多達(dá)上萬種，其中植物藥占絕大比例[8]，由于植物源和動物源藥材的有效成分主要分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間質(zhì)，尤以細(xì)胞內(nèi)為主，因此，如何最大限度釋放藥材活性成分涉及到破壞細(xì)胞壁的問題[9]。超微粉碎技術(shù)可達(dá)到細(xì)胞破碎的目的，使活性成分暴露在細(xì)胞外，從而更加容易被溶劑提取或被人體吸收，提高藥材的生物利用度。

不同中藥具有不同的顯微特征，細(xì)胞破壁率的測定方法也不同，天麻的顯微特征包括薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞、草酸鈣針晶、糊化多糖、導(dǎo)管等，其中薄壁細(xì)胞是天麻的主要組織細(xì)胞[10]，呈類多角形或長多角形，顯微鏡下易于觀察，且內(nèi)部含有糊化多糖顆粒，適合作為檢測指標(biāo)進(jìn)行細(xì)胞破壁率的測定。目前還沒有關(guān)于天麻超微粉細(xì)胞破壁率測定文獻(xiàn)的報道，本研究采用顯微計數(shù)法測定天麻超微粉的細(xì)胞破壁率，旨在為后續(xù)天麻超微飲片的質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。

1材料、儀器及試劑

1.1藥材

收集于西藏林芝波密縣，經(jīng)廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司按照2015版中國藥典檢測合格[2]。

1.2儀器

DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機（江陰市新安粉體設(shè)備有限公司）;BFM6型“貝利”振動式微粉機（濟南貝利粉技術(shù)工程有限公司）;XSP-35TV-1600X型靈峰光學(xué)顯微鏡（上饒靈峰光學(xué)儀器廠）;BT-2001型激光粒度分布儀（丹東百特儀器有限公司）。

1.3試劑

醋酸;甘油（廣州化學(xué)試劑廠）;水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1樣品制備

2.1.1粗粉制備? 天麻藥材500 g干燥至水分10%左右，粉碎成粗粉（30目），備用。

2.1.2超微粉制備? 取30目粗粉轉(zhuǎn)移至貝利振動式微粉機中進(jìn)行超微粉碎20 min，得天麻超微粉，采用激光粒度分析儀檢測粒度，超微粉粒度分布D90為40.61 μm，備用。

2.2天麻粗粉細(xì)胞計數(shù)[11]

2.2.1天麻粉末及切片顯微制片? 精密稱取天麻粗粉（30目）3.1770 g，置于25 ml容量瓶中，粉末經(jīng)稀鹽酸浸泡除去白色乳濁液后用蒸餾水洗滌，然后加入水合氯醛溶液定容至刻度，超聲處理5 min，使粉末均勻分散;將容量瓶置90℃水浴鍋中加熱10 min左右，使天麻粗粉透化完全，然后用移液槍吸取6份，分別為30 μl（相當(dāng)于3.8124 mg粉末）、60 μl（相當(dāng)于7.6248 mg粉末）、90 μl（相當(dāng)于11.4372 mg粉末）、120 μl（相當(dāng)于15.2496 mg粉末）、150 μl（相當(dāng)于19.062 mg粉末）、180 μl（相當(dāng)于22.8744 mg粉末），將其分別滴在載玻片上，將載玻片放在水浴鍋表面加熱，揮干溶劑后滴加醋酸甘油水，用蓋玻片壓平裝片（裝片時防止氣泡產(chǎn)生，使混懸液布滿整個蓋玻片，以不溢出為度），分別置于顯微鏡下觀察。天麻藥材水中浸泡5 h后用美工刀切取薄片，置載玻片上滴加水合氯醛溶液1～2滴，置酒精燈火焰上來回移動加熱，重復(fù)3次，用濾紙吸干殘余水合氯醛溶液，滴加醋酸甘油水溶液，用蓋玻片壓平裝片，置顯微鏡下觀察。

2.2.2天麻薄壁細(xì)胞計數(shù)? 從“2.1”下的天麻粗粉顯微特征圖（圖1）可以看出，天麻中最主要的細(xì)胞為薄壁細(xì)胞，薄壁細(xì)胞中含有大量的糊化多糖顆粒，另外還存在少量的厚壁細(xì)胞?！?.1”下的天麻超微粉（圖2）中除糊化多糖外，其他組織基本破碎，因此，選擇天麻中的主要細(xì)胞即薄壁細(xì)胞為特征性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。以1個視野為1個計數(shù)單位，觀察30、60、90、120、150、180 μl六個體積的天麻粗粉混懸液所制得載玻片中完整的薄壁細(xì)胞數(shù)目，每個載玻片取8個計數(shù)單位的平均值，具體見圖3，對應(yīng)的細(xì)胞個數(shù)分別為16.875、26.125、31.125、36.875、38.500、40.000。

A.低倍鏡下天麻橫切面（100×）;B.高倍鏡下天麻粗粉中觀察到的薄壁細(xì)胞（400×）;C.高倍鏡下天麻粗粉中觀察到的厚壁細(xì)胞（400×）

A.天麻超微粉在低倍鏡下的整體特征（100×）;B.天麻超微粉在高倍鏡下觀察到的糊化多糖顆粒（400×）

2.3細(xì)胞數(shù)目與粉末質(zhì)量相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

以粗粉的稱樣量（X）為橫坐標(biāo)，每個計數(shù)單位中薄壁細(xì)胞的個數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=1.1879X+15.733，r=0.9556，提示天麻粗粉中薄壁細(xì)胞個數(shù)在3.8124～22.8744 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可作為顯微特征計數(shù)指標(biāo)（圖4）。

2.4天麻粗粉細(xì)胞計數(shù)方法學(xué)考察

2.4.1精密度考察? 精密稱取3.0038 g天麻粗粉，同“2.2.1”方法制片6份，分別觀察8個視野，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.11%，提示本方法精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性考察? 取“2.4.1”下樣品，室溫放置，分別于0、3、6、9、12 h在顯微鏡下觀察，RSD為7.45%，提示樣品混懸液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性考察? 取6份相同質(zhì)量的同一批天麻粗粉，相同方法制片，于顯微鏡下觀察，薄壁細(xì)胞個數(shù)RSD為6.24%，提示本方法重復(fù)性良好。

2.5天麻超微粉破壁率測定

精密稱取天麻超微粉3.0175 g，加水合氯醛溶液定容，取60、90、120 μl混懸液，分別置于載玻片上，按照“2.2.1”的方法制片，于顯微鏡下觀察（圖2），分別觀察8個視野，計數(shù)3個體積混懸液中完整薄壁細(xì)胞的個數(shù)，然后根據(jù)線性回歸方程式Y(jié)=1.1879X+15.733計算3個體積混懸液對應(yīng)天麻粗粉質(zhì)量中薄壁細(xì)胞的個數(shù);最后，根據(jù)天麻粗粉薄壁細(xì)胞數(shù)和超微粉薄壁細(xì)胞數(shù)目，按以下公式計算破壁率[12]：Y=（A-B）/A×100%，其中“Y”表示薄壁細(xì)胞破壁率，“A”表示天麻粗粉薄壁細(xì)胞個數(shù);“B”表示天麻超微粉薄壁細(xì)胞個數(shù)，“W”表示天麻混懸液中粉末的質(zhì)量，各項指標(biāo)見表1。結(jié)果顯示，超微粉碎技術(shù)可以使天麻飲片的破壁率達(dá)到100%，以天麻薄壁細(xì)胞為計數(shù)指標(biāo)，具有科學(xué)性、可行性。

3討論

由于超微粉碎技術(shù)的發(fā)展，中藥超微飲片隨之而誕生，其中天麻超微飲片已上市銷售。超微粉的制備是生產(chǎn)破壁飲片的重要環(huán)節(jié)，而細(xì)胞破壁率是評價超微粉質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。目前，已有學(xué)者對丹參[13]、苦瓜[14]和鐵皮石斛[15-16]等植物的超微粉細(xì)胞破壁率測定進(jìn)行了研究，參考以上幾種藥材細(xì)胞破壁率的測定方法，本文探討了天麻超微粉細(xì)胞破壁率的測定，旨在為評價超微粉的細(xì)胞破碎程度提供參考和依據(jù)。

天麻主要含薄壁細(xì)胞，并且薄壁細(xì)胞中可見大量的糊化多糖顆粒，可推測有效成分天麻素和天麻多糖主要存在于薄壁細(xì)胞中，因此，以薄壁細(xì)胞為超微粉碎指標(biāo)性特征細(xì)胞，并以薄壁細(xì)胞的破壁率作為超微粉碎的評價指標(biāo)具有科學(xué)性。

本實驗通過對比不同目數(shù)的天麻粗粉，發(fā)現(xiàn)30目的粗粉細(xì)胞完整度較高，且薄壁細(xì)胞成片存在，易于計數(shù)，但30目粗粉因顆粒較大，在制片時易產(chǎn)生氣泡，因此，需要在使用水合氯醛溶液透化前用適當(dāng)稀鹽酸溶液處理，除去干擾顯微觀察的白色乳濁樣物質(zhì)，并使顆粒軟化后易于擠壓制片，這是本實驗的一大發(fā)現(xiàn)。

本實驗首次對天麻超微粉進(jìn)行破壁率測定，測定細(xì)胞破壁率的關(guān)鍵在于回歸方程的精確性和細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性，由于天麻中除了薄壁細(xì)胞外還含有少量的厚壁細(xì)胞，因此，在細(xì)胞計數(shù)前需充分透化天麻粉末，使顯微觀察時能更好地區(qū)分薄壁細(xì)胞和厚壁細(xì)胞。天麻粉末顯微制片透化方法后續(xù)還需廣大學(xué)者繼續(xù)改進(jìn)，使天麻超微粉的破壁率測定更加精確，為天麻超微飲片的質(zhì)量控制研究提供參考和依據(jù)。

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（收稿日期：2018-12-18? 本文編輯：祁海文）