阿托伐他汀抑制動(dòng)脈粥樣硬化患者NLRP3炎性體途徑的研究

李奕萍 王紅琴 王健 鄭文華 陳建忠

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）多由脂肪代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)引起，常導(dǎo)致血栓形成、供血障礙等，也是冠心病等心血管疾病的首要病因。目前研究表明，AS是一種慢性炎性疾病，炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用[1]，尤其是免疫應(yīng)答介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[2]。有學(xué)者提出含熱蛋白結(jié)構(gòu)域3的核苷酸結(jié)合寡聚化樣受體（NLRP3）炎性體激活途徑[3]在AS發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用[4-5]。他汀類藥物是冠心病、高血壓以及腦血管病的預(yù)防藥物，其中阿托伐他汀進(jìn)入體內(nèi)不需代謝即可有生物活性，具有見效快、降脂作用強(qiáng)以及持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，可有效降低心血管疾病的發(fā)病率和病死率。阿托伐他汀治療心血管疾病的原理在于它可抑制內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞（MDM）的增殖和轉(zhuǎn)移，但其對(duì)NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)作用報(bào)道較少。本研究通過觀察阿托伐他汀治療前后AS患者NLRP3炎性體相關(guān)分子的表達(dá)和IL-1β、IL-18等細(xì)胞因子的變化，以及體外阿托伐他汀對(duì)NLRP3炎性體活化途徑的調(diào)節(jié)作用，探討阿托伐他汀治療AS的免疫學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2015年1月至2016年12月在本院診治的AS患者30例，均經(jīng)超聲檢查確診。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)超聲檢查確診為AS，即血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)-中膜厚度1.0~1.2mm或管腔內(nèi)粥樣硬化斑塊形成、管腔狹窄；（2）既往未接受過阿托伐他汀類藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有急性感染的臨床表現(xiàn)；（2）嚴(yán)重腎功能衰竭；（3）患有痛風(fēng)、類風(fēng)濕疾病、糖尿病、惡性腫瘤或其他嚴(yán)重消耗性疾??；（4）長(zhǎng)期服用激素或免疫抑制劑?；颊咧心?18 例，女 12 例；年齡 50~81（70.1±8.6）歲；收縮壓（SBP）為（125.56±18.98）mmHg，舒 張 壓（DBP）為（82.39±8.09）mmHg，空腹血糖 （5.98±2.14）mmol/L，TC（5.21±1.09）mmol/L，HDL-C 為（1.38±0.41）mmol/L，LDLC 為（3.07±0.88）mmol/L，TG 為（1.96±1.16）mmol/L。

1.2 主要試劑和儀器 立普妥（阿托伐他汀鈣片）購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司，（規(guī)格：20mg/片，批號(hào)：M91692）；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自挪威Stem cell公司，脂多糖（LPS）、膽固醇、佛波酯（PMA）均購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司，IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，Trizol試劑盒和SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒均購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司，尼日利亞菌素購(gòu)自美國(guó)Invivogen公司，NLRP3、ASC、IL-1β引物自行設(shè)計(jì)后由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 IL-1β和IL-18在血漿和單核細(xì)胞來源的MDM中表達(dá)水平的檢測(cè) 采用ELISA法。患者在阿托伐他汀治療（20mg/d，口服）前1d以及治療后2個(gè)月分別采集空腹靜脈血10ml，肝素抗凝，以1 200r/min離心10min，收集血漿于試管中，-80℃冰箱保存待檢；將分離血漿后的剩余細(xì)胞用PBS稀釋1倍后，加入含淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞再分化為MDM，用膽固醇結(jié)晶刺激，收集細(xì)胞懸液上清液于試管中，-80℃冰箱保存待檢。IL-1β和IL-18表達(dá)水平檢測(cè)按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-1β和IL-18的表達(dá)水平。

1.4 NLRP3炎性體相關(guān)分子和IL-1β mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將MDM根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取總RNA，加入20μl的焦碳酸二乙酯水溶解，測(cè)定RNA的濃度和OD比值，符合要求后按照SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20μl反應(yīng)體系中包括 dNTP mix 4μl，SuperRT 1μl，5×RT Buffer 4μl，RNA 2μl，引物 2μ1，DEPC水7μl，反應(yīng)物4℃儲(chǔ)存待用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行，20μl反應(yīng)體系中含 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μl，PCR 上游和下游引物各 1μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA 溶液）2μl，DEPC 水 6μl，在定量 PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為 95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，并使用溶解曲線分析引物特異性。用2-ΔΔCt法計(jì)算出每組樣本的mRNA表達(dá)量，每種檢測(cè)重復(fù)3次。引物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)和合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 阿托伐他汀對(duì)單核巨噬細(xì)胞株（THP-1）NLRP3炎性體激活的調(diào)節(jié)作用 THP-1細(xì)胞用50nM PMA處理24h分化為MDM。為觀察不同濃度阿托伐他汀對(duì)NLRP3炎性體激活途徑的影響，用尼日利亞菌素單獨(dú)或聯(lián)合不同濃度阿托伐他汀處理細(xì)胞30min，分組如下：?jiǎn)为?dú)尼日利亞菌素處理組為對(duì)照組，尼日利亞菌素聯(lián)合1μmol/L阿托伐他汀處理組為低濃度組，尼日利亞菌素聯(lián)合10μmol/L阿托伐他汀處理組為中濃度組，尼日利亞菌素聯(lián)合20μmol/L阿托伐他汀處理組為高濃度組。為觀察阿托伐他汀處理時(shí)間對(duì)NLRP3炎性體激活途徑的影響，用尼日利亞菌素單獨(dú)或聯(lián)合10μmol/L濃度阿托伐他汀不同時(shí)間處理細(xì)胞，分組如下：?jiǎn)为?dú)尼日利亞菌素處理組為對(duì)照組，尼日利亞菌素聯(lián)合10μmol/L阿托伐他汀處理12、24、48h為12h組、24h組、48h組。具體操作流程：在用10μmol/L阿托伐他汀處理MDM不同時(shí)間后，加入10μmol/L的尼日利亞菌素作用30min，收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β和IL-18的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 AS患者治療前后血漿中IL-1β、IL-18表達(dá)水平的比較 30例AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后，IL-1β和IL-18在血漿中的表達(dá)水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 30例AS患者治療前后血漿中IL-1β、IL-18表達(dá)水平的比較（pg/ml）

2.2 AS患者治療前后MDM中IL-1β、IL-18表達(dá)水平的比較 30例AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后，IL-1β、IL-18在MDM中的表達(dá)水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 30例AS患者治療前后MDM中IL-1β、IL-18表達(dá)水平的比較（pg/ml）

2.3 AS患者治療前后NLRP3、ASC和IL-1β mRNA表達(dá)水平的比較 30例AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后，MDM中NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達(dá)水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 30例AS患者治療前后NLRP3炎性體相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平的比較

2.4 阿托伐他汀不同濃度與不同處理時(shí)間對(duì)THP-1細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18抑制作用的比較 與對(duì)照組比較，低、中、高濃度組IL-1β和IL-18的表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且隨著阿托伐他汀濃度越大，下降越明顯，見表5。與對(duì)照組比較，12、24、48h組IL-1β和IL-18的表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且隨著處理時(shí)間越長(zhǎng)，下降越明顯，見表6。

表5 不同濃度阿托伐他汀對(duì)THP-1細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18 的抑制作用（pg/ml）

表6 不同時(shí)間阿托伐他汀處理對(duì)THP-1細(xì)胞分泌IL-1β和IL-18的抑制作用（pg/ml）

3 討論

AS是一種以脂質(zhì)沉積、白細(xì)胞浸潤(rùn)和血管平滑肌細(xì)胞增殖為主要特征的慢性炎癥性疾病，但是到目前為止，導(dǎo)致AS發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全闡明[1]，但免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)與其密切相關(guān)[2]。近年來研究表明，損傷的組織和細(xì)胞產(chǎn)生的損傷/危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（DAMPs）能被模式識(shí)別受體（PRR）識(shí)別后介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。這些模式識(shí)別受體包括Toll樣受體（TLR）、核苷酸結(jié)合寡聚化樣受體（NLR）、視黃酸誘導(dǎo)基因樣受體（RLR）和C型凝集素樣受體（CLR）等，其中NLR識(shí)別DAMPs后能形成由NLR、接頭蛋白ASC、Caspase-1等形成的稱為炎性體的分子的復(fù)合物[3]。炎性體形成后能激活Caspase-1，活化的Caspase-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學(xué)活性的IL-1β和IL-18，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性體是研究最多的一種，NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和Caspase-1組成的[4]。多種內(nèi)源性刺激物如膽固醇結(jié)晶、葡萄糖、游離脂肪酸、尿酸鈉（MSU）結(jié)晶及胞質(zhì)外ATP和外源性刺激物如細(xì)菌、病毒等成分均能誘導(dǎo)NLPR3的活化，通過誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子如IL-1β的產(chǎn)生，其在AS[4-6]、糖尿病[7]、阿爾茨海默病[8]、痛風(fēng)[9]等免疫炎癥性疾病中的作用日益受到重視。

近年來研究發(fā)現(xiàn)固有免疫細(xì)胞如MDM、內(nèi)皮細(xì)胞吞噬游離脂肪酸（FFA）、膽固醇結(jié)晶后，可激活炎性體途徑，釋放炎癥因子如IL-1β、TNF-α等，在AS的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[4-6]。如研究發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶能激活MDM炎性體的形成，并發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白能促進(jìn)膽固醇結(jié)晶的形成并作為初始信號(hào)促進(jìn)NLRP3和IL-1β的表達(dá)[5]。本課題早期研究[6]與相關(guān)報(bào)道均發(fā)現(xiàn)，AS患者血漿中的IL-1β和IL-18的水平顯著高于對(duì)照組，其中分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步分化為MDM，定量 PCR 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn) NLRP3、ASC、IL-1β 的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，用一定濃度的膽固醇結(jié)晶刺激后發(fā)現(xiàn)AS患者的MDM的TNF-α、IL-1β的分泌水平均顯著高于對(duì)照組，提示AS患者可能存在慢性低度炎癥狀態(tài)，NLRP3炎性體激活與AS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。此外，AS患者的大動(dòng)脈[10]、頸動(dòng)脈硬化斑塊[11]和皮下脂肪組織[12]中均發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體相關(guān)分子如NLRP3、ASC等表達(dá)升高，且與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，NLRP3炎性體激活可導(dǎo)致消皮素D（GSDMD）分子的活化，后者可在細(xì)胞膜上形成孔道，有利于促進(jìn)IL-1β的分泌[13]，在AS患者中GSDMD是否表達(dá)升高目前還沒有報(bào)道，但由于活化的GSDMD是IL-1β分泌的必需成分，推測(cè)可能與其活性升高密切相關(guān)。以上結(jié)果提示由膽固醇結(jié)晶刺激引起的NLRP3炎性體激活途徑可能在AS的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。有關(guān)膽固醇結(jié)晶激活NLRP3炎性體的分子機(jī)制，有學(xué)者推測(cè)膽固醇結(jié)晶被MDM吞噬后可導(dǎo)致吞噬溶酶體的不穩(wěn)定性或破裂，引起溶酶體的組織蛋白酶B釋放激活NLRP3 炎性體[4-5]。

他汀類藥物是一類羥甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA） 還原酶抑制劑，因其降脂作用強(qiáng)效、穩(wěn)定、安全，臨床上已被廣泛用于高脂血癥的治療與預(yù)防[14-15]。近來的臨床研究大量數(shù)據(jù)已經(jīng)證明他汀類藥物在冠心病患者中除有降脂作用外還具有改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊及抗AS的作用，其中上述作用機(jī)制的分子機(jī)制涉及到他汀類藥物的抗炎作用[14]。C-反應(yīng)蛋白（CRP）是反應(yīng)機(jī)體炎癥的敏感治療，近期有研究顯示，冠心病患者在使用阿托伐他汀后，CRP水平明顯下降，表明阿托伐他汀具有抗炎效應(yīng)[14]，但其調(diào)控機(jī)制不甚清楚。另外，在對(duì)心力衰竭的患者研究中發(fā)現(xiàn)，他汀藥物具有降低血清中細(xì)胞炎癥因子的效應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。隨著NLRP3炎性體在AS發(fā)病中的作用被揭示，其在臨床治療中相關(guān)性日益受到關(guān)注，如研究報(bào)道急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛患者經(jīng)高劑量的瑞舒伐他汀鈣片（20mg/d）治療4周后，血漿中IL-1β和IL-18水平顯著下降[16]，但也有報(bào)道冠心病患者在經(jīng)瑞舒伐他汀治療8個(gè)月后，NLRP3炎性體相關(guān)分子表達(dá)和血漿中IL-1β和IL-18水平?jīng)]有變化，但是阿托伐他汀治療能引起IL-1β和IL-18顯著下降[17]，這些結(jié)果不一致可能與劑量和觀察時(shí)間不同有一定的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療一段時(shí)間后，血漿中IL-1β和IL-18下降，NLRP3炎性體相關(guān)分子如NLRP3、ASC等表達(dá)也降低，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的阿托伐他汀藥物能抑制經(jīng)尼日利亞菌素刺激后THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和IL-18，且呈劑量依賴性，表明阿托伐他汀藥物在體內(nèi)可能對(duì)膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)的炎性體激活具有抑制作用，從而在AS的治療中發(fā)揮作用。有學(xué)者報(bào)道阿托伐他汀藥物能通過抑制TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)途徑抑制THP-1細(xì)胞中NLRP3炎性體激活[18]，另有研究發(fā)現(xiàn)PKA能通過引起NLRP3蛋白291絲氨酸位點(diǎn)磷酸化和泛素化修飾抑制NLRP3炎性體的激活，從而改善炎癥性疾病的病理發(fā)生[17]，而早期文獻(xiàn)報(bào)道阿托伐他汀能通過激活PKA抑制葡萄糖反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的功能[20]，目前本研究團(tuán)隊(duì)正在研究阿托伐他汀是否也能通過激活PKA而抑制NLRP3炎性體激活。

本研究發(fā)現(xiàn)AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后血漿IL-1β和IL-18水平顯著下降，同時(shí)MDM中NLRP3炎性體相關(guān)分子的表達(dá)水平和膽固醇結(jié)晶刺激后MDM產(chǎn)生IL-1β和IL-18的水平經(jīng)治療后也顯著降低，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀藥物能抑制尼日利亞菌素刺激THP-1細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和IL-18，提示阿托伐他汀在體內(nèi)可能通過抑制NLRP3炎性體的激活而在AS的治療中發(fā)揮作用，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研制開發(fā)有效的AS治療藥物提供了一定的思路。

（收稿日期：2017-08-28）

（本文編輯：俞駿文）