鼻咽癌EGFR、HLA-F表達(dá)水平及調(diào)強(qiáng)放療預(yù)后的影響因素分析

王勇 吳波 孫華麗 胡煒 熊華才 李傳頂 劉艷梅 陳衛(wèi)軍 應(yīng)申鵬

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，也是免疫相關(guān)性腫瘤[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及血管形成等過程中起重要作用，其過度表達(dá)與包括鼻咽癌等多種惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)。近年來，多項(xiàng)基礎(chǔ)研究表明EGFR參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)，與人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）存在相關(guān)性[2]。EGFR抑制劑可以上調(diào)包括HLA在內(nèi)的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類基因的表達(dá)[3]。HLA多態(tài)性也可以影響EGFR抑制劑治療的免疫調(diào)節(jié)表現(xiàn)：皮疹反應(yīng)[4]。HLA-F是HLAⅠ類分子之一，HLA-F編碼的蛋白主要為人類組織相容性抗原，可以影響T淋巴細(xì)胞的分化及免疫因子的釋放，從而介導(dǎo)免疫系統(tǒng)反應(yīng)、免疫應(yīng)答及免疫損傷。在人類很多腫瘤中可檢測(cè)到HLA-F過度表達(dá)，基礎(chǔ)研究表明HLA-F與鼻咽癌相關(guān)，但鮮有相關(guān)臨床研究報(bào)道。本研究擬分析EGFR和HLA-F在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平及預(yù)測(cè)鼻咽癌調(diào)強(qiáng)放射治療預(yù)后的價(jià)值，為腫瘤個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 我院2007年1月至2017年12月收治鼻咽癌放療患者120例，其中男85例，女35例，年齡27～88歲，中位年齡55歲。組織學(xué)類型：角化性鱗癌16例，非角化性鱗癌104例。根據(jù)UICC第7版分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，Ⅲ期55例，Ⅳa期25例。單純放療37例，放療加化療83例。

1.2 HLA-F和EGFR的免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 鼻咽癌組織標(biāo)本為患者治療前在鼻咽鏡活檢時(shí)獲得。HLA-F和EGFR免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑分別為兔抗人HLA-F 單克隆抗體（mAb EPR6803,1∶300，英國(guó) Abcam公司產(chǎn)品）和鼠抗人EGFR蛋白單克隆抗體（18986-1-AP，中國(guó)武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），均按照試劑盒操作說明進(jìn)行操作。以IgG1封閉HLA-F抗原后作為陰性對(duì)照，皮膚癌組織用于陽性對(duì)照EGFR；陰性對(duì)照使用PBS代替一抗。EGFR和HLA-F蛋白陽性染色均呈棕黃或棕褐色，且定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜。

1.3 結(jié)果判斷 結(jié)果判別由病理科醫(yī)師采用獨(dú)立雙盲半定量評(píng)估，每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野,以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計(jì)分[5]，0分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。0～4分定義為低表達(dá)，5～12分定義為高表達(dá)。

1.4 治療方法和隨訪 所有入組病例均經(jīng)病理確診后，接受根治性調(diào)強(qiáng)適形放射治療，參考RTOG 0615劑量標(biāo)準(zhǔn)[6]，設(shè)計(jì)并優(yōu)化調(diào)強(qiáng)計(jì)劃。所有患者腫瘤劑量為70Gy，2.12Gy/F，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶照射劑量66Gy，2Gy/F，預(yù)防區(qū)照射劑量50Gy，2Gy/F。臨床分期為Ⅱ~Ⅳ期病例采取同步放化療，酌情誘導(dǎo)化療或放療后輔助化療，誘導(dǎo)化療或輔助化療為以鉑類為基礎(chǔ)的雙藥或三藥聯(lián)合方案，同步化療方案為每周順鉑30～40mg/m2，其中19例患者因基礎(chǔ)疾病和其它特殊原因未接收化療。入組患者放療結(jié)束后開始隨訪，前2年每3個(gè)月及第3年開始每半年進(jìn)行一次隨訪，不能來院復(fù)診患者電話隨訪。來院隨訪內(nèi)容包括全面的體檢及輔助檢查，每半年復(fù)查一次鼻咽部MRI。隨訪時(shí)間以診斷日期開始計(jì)算至死亡或末次隨訪日期。中位隨訪時(shí)間為43.4個(gè)月（10.6~100個(gè)月）。無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）定義為：從確診開始至腫瘤（任何方面）進(jìn)展或（因任何原因）死亡之間的時(shí)間?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為：從確診開始至（因任何原因）死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以 表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier生存曲線分析PFS和OS，生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用單因素、多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估EGFR和HLA-F兩因素預(yù)測(cè)預(yù)后的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。蛋白表達(dá)水平的關(guān)系分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存和死亡患者臨床特征比較 根據(jù)隨訪結(jié)果將患者分為生存組和死亡組，兩組患者臨床特征比較見表1。

由表1可見，生存和死亡患者的性別和病理類型的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而年齡、T分期、N分期和臨床分期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 120例鼻咽癌患者EGFR和HLA-F表達(dá)水平與臨床特征關(guān)系 見表2。

由表2可見，EGFR≥（++）表達(dá)率為70.8%（85/120），HLA-F≥（++） 表達(dá)率為 66.7%（80/120）。EGFR、HLA-F表達(dá)水平與患者的性別、年齡、組織病理學(xué)分型間均無相關(guān)性（均P＞0.05），而與患者T分期、N分期、臨床分期間有相關(guān)性（均P＜0.05）。

表1 生存和死亡患者臨床特征比較（例）

表2 120例鼻咽癌患者EGFR、HLA-F表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系（例）

表3 120例鼻咽癌患者EGFR、HLA-F表達(dá)水平預(yù)測(cè)PFS、OS的單因素分析

2.3 HLA-F和EGFR表達(dá)水平預(yù)測(cè)鼻咽癌調(diào)強(qiáng)放療預(yù)后的單因素分析 見表3。

由表3可見，單因素分析顯示T分期、N分期、EGFR表達(dá)水平、HLA-F表達(dá)水平、EGFR+HLA-F表達(dá)水平是預(yù)測(cè)鼻咽癌患者PFS、OS的影響因素，年齡是OS的影響因素。

2.4 HLA-F和EGFR表達(dá)水平預(yù)測(cè)鼻咽癌調(diào)強(qiáng)放療預(yù)后的多因素分析 見表4。

由表4可見，多因素分析顯示，T分期是預(yù)測(cè)PFS的獨(dú)立影響因素，EGFR+HLA-F表達(dá)水平是預(yù)測(cè)OS的獨(dú)立影響因素。

2.5 HLA-F和EGFR與鼻咽癌調(diào)強(qiáng)放療預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高EGFR、高HLA-F患者的PFS和OS均差于低表達(dá)組（圖1、2，見插頁(yè)）。根據(jù)EGFR、HLA-F表達(dá)水平分組，分為高EGFR+高HLA-F、高 EGFR+低 HLA-F、低 EGFR+高 HLA-F 和低EGFR+低HLA-F 4組，采用Kaplan-Meier生存曲線分析，高EGFR+高HLA-F患者的PFS和OS均差于其它組（圖3，見插頁(yè)）。進(jìn)一步分析顯示，死亡組EGFR高表達(dá)34例（85.0%），HLA-F高表達(dá)為 35例（87.5%），EGFR+HLA-F高表達(dá)34例（85.0%）;生存組EGFR高表達(dá)50例（62.5%），HLA-F高表達(dá)45例（56.3%），EGFR+HLAF高表達(dá)33例（41.3%）。

表4 120例鼻咽癌患者EGFR、HLA-F表達(dá)水平預(yù)測(cè)PFS、OS的多因素分析

2.6 HLA-F和EGFR蛋白表達(dá)相關(guān)性 HLA-F和EGFR表達(dá)水平在鼻咽癌組織中呈正相關(guān)（r=0.28，P=0.002）。

3 討論

放射抗拒是導(dǎo)致鼻咽癌預(yù)后不良的重要原因，研究表明，EGFR高表達(dá)與鼻咽癌放射抗拒相關(guān)，EGFR抑制劑可以提高鼻咽癌的放射敏感性，進(jìn)而提高生存獲益[7-8]。當(dāng)前腫瘤治療進(jìn)入免疫時(shí)代，研究表明在鼻咽癌免疫調(diào)節(jié)方面，EGFR和HLA存在相關(guān)性，且共同參與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)[2]。

EGFR突變或過表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤放療抵抗，導(dǎo)致預(yù)后不良[9]。本研究利用免疫組化方法檢測(cè)EGFR在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示EGFR總陽性表達(dá)率為88.3%，高表達(dá)率為70.8%。陽性表達(dá)率與文獻(xiàn)報(bào)道的68%~89%相似[10]。本研究顯示EGFR表達(dá)水平和T、N分期有關(guān)，Zhang等[11]進(jìn)行的一項(xiàng)回顧性研究表明，EGFR表達(dá)于89.5%的鼻咽癌患者，且于與鼻咽癌的T和有無頸部淋巴轉(zhuǎn)移（N分期）有關(guān)，其EGFR陽性表達(dá)患者3年生存率更低（75.8%vs 91.2%），且為獨(dú)立的不良預(yù)后因子（β=3.93；χ2=11.95；P=0.001）。Cao 等[12]的研究顯示EGFR與鼻咽癌的T分期有關(guān)，與N分期無關(guān)。本研究中EGFR高表達(dá)組5年P(guān)FS和OS時(shí)間均差于低表達(dá)組，死亡組中高EGFR表達(dá)高于低表達(dá)的5倍。單因素分析顯示EGFR表達(dá)是PFS和OS影響因子（P=0.017、0.003），但多因素分析EGFR不是獨(dú)立影響因子。雖與上述這些研究的結(jié)果并不完全一致。但可以肯定的是EGFR過表達(dá)是鼻咽癌患者的不良預(yù)后因素，支持許多觀察性研究提示EGFR是判斷預(yù)后較為理想的生物學(xué)標(biāo)志物的結(jié)論[13]。

HLA-F屬于非經(jīng)典型HLAⅠ類抗原，主要功能是參與免疫調(diào)節(jié)，維持免疫耐受免疫系統(tǒng)失調(diào)影響鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展[1]。多項(xiàng)基礎(chǔ)研究表明HLA-F與鼻咽癌易感性存在密切聯(lián)系[14-15]。Li等[16]通過構(gòu)建CNE-2-Rs和6-10B-Rs兩個(gè)鼻咽癌細(xì)胞株，分析了miRNA和對(duì)應(yīng)的mRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA-F mRNA高表達(dá)，表明HLA-F與鼻咽癌相關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)2 340例中國(guó)南方NPC患者和1 166例健康志愿者的研究篩選出包括HLA-F在內(nèi)的7個(gè)HLA差異性單核苷酸多態(tài)性（SNP），依據(jù)Hardy-Weinberg equilibrium（HWE）假設(shè)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HLA-F影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[15]。從基因?qū)W水平肯定了HLA抗原，尤其是HLA-F，在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)HLA-F分子存在異常表達(dá)水平，并明顯影響患者預(yù)后，且不同類型間的腫瘤表現(xiàn)出不同的臨床相關(guān)性，包括如非小細(xì)胞肺、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等許多癌癥類型中都被過度表達(dá)[17-18]。Ishigami等[19]對(duì)日本胃癌患者的研究發(fā)現(xiàn)HLA-F與胃癌患者預(yù)后呈相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)HLA-F表達(dá)和腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管和淋巴管侵犯等相關(guān)。徐永富等[21]研究顯示HLA-F在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)是獨(dú)立預(yù)后影響因子。本研究顯示HLA-F陽性總表達(dá)率為85.3%，高表達(dá)率為66.7%。HLA-F高表達(dá)組患者PFS、OS明顯差于低表達(dá)組。死亡組中HLA-F高表達(dá)是低表達(dá)的7倍。HLA-F表達(dá)水平與性別、年齡、病理分型無關(guān)，而與T、N分期相關(guān)，表明HLA-F表達(dá)水平與鼻咽癌存在臨床相關(guān)性。單因素分析顯示，HLA-F高低表達(dá)水平是患者PFS、OS的影響因素（P=0.044、0.000），但多因素分析顯示HLA-F不是其獨(dú)立影響因素。

本研究表明EGFR和HLA-F表達(dá)水平有顯著的相關(guān)性。單因素分析顯示T分期、N分期、EGFR素表達(dá)水平、HLA-F表達(dá)水平是PFS、OS的影響因素，但多因素分析提示患者T分期（P=0.001）是PFS的獨(dú)立影響因素，EGFR+HLA-F表達(dá)水平是患者OS的獨(dú)立預(yù)后影響因素（P=0.025）。高EGFR+高HLA-F表達(dá)患者5年P(guān)FS、OS分別為54%、29%均較其它組合低。死亡組中高EGFR+高HLA-F的高占比，提示EGFR、HLA-F高表達(dá)能提高鼻咽癌的放射抗拒性，這可能與EGFR與HLA協(xié)同參與相關(guān)腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)。Srivastava等[21]報(bào)道在頭頸部腫瘤中，EGFR通過抑制SHP-2/STAT1誘導(dǎo)HLA下調(diào)，HLAⅠ類分子上調(diào)與EGFR抑制劑療效顯著相關(guān)，即EGFR抑制劑可以阻斷EGFR誘導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制并通過重建STAT1信號(hào)以逆轉(zhuǎn)HLA下調(diào)，從而達(dá)到適應(yīng)性細(xì)胞免疫。

綜上所述，本研究首次為HLA-F表達(dá)水平影響鼻咽癌患者調(diào)強(qiáng)放療預(yù)后提供了證據(jù)，HLA-F的表達(dá)水平在鼻咽癌中具有臨床意義。聯(lián)合檢測(cè)EGFR和HLAF表達(dá)水平有助于鼻咽癌調(diào)強(qiáng)放療預(yù)后的分析。HLA-F和EGFR的相關(guān)性即信號(hào)通路交互影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本文一部分患者的隨訪時(shí)間還不夠長(zhǎng)，可能對(duì)結(jié)果存在影響。