炎性細胞因子對滑膜細胞誘導型一氧化氮合酶和一氧化氮表達的作用及其機制研究

陳澤琪 傅佳民 楊娣 金彬 王芯葉 吳冬蕾 羅心靜 莫選榮

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種主要累及周圍關節(jié)的慢性炎癥性自身免疫性疾病?；こ衫w維細胞及其生成的炎癥介質在RA關節(jié)滑膜炎癥和關節(jié)破壞中起重要作用。一氧化氮（NO）是一種生物自由基,在體內經(jīng)一氧化氮合酶（NOS）催化并由L-精氨酸生成。NOS有3種，其中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）是 NO生產過程中的關鍵酶。NO具有廣泛的生理病理作用，生理量的NO介導和調節(jié)多種生理過程，其參與血管調節(jié)、神經(jīng)遞質的傳遞、抗病毒反應和免疫反應,但過量的NO可造成組織損傷，并會參與多種急性和慢性炎癥性疾病的病理過程[1]。研究表明RA患者關節(jié)液和血清中的NO水平明顯高于正常人[2]，應用iNOS抑制劑可顯著緩解佐劑關節(jié)炎大鼠的關節(jié)腫脹、滑膜炎癥和軟骨損傷[3-4]。因此認為NO和iNOS作為炎癥介質在RA病變中起重要作用，調控NO和iNOS的表達是防治RA的重要靶點[6]。

核因子 κB（nuclear factor，NF-κB）通路作為在 RA中發(fā)揮重要作用的信號通路之一，參與多種細胞因子的生成調節(jié)[7-8]。有研究證實，IL-1、IFN-γ、TNF-α 等炎性細胞因子聯(lián)合刺激巨噬細胞產生大量NO和iNOS，而NF-κB參與NO和iNOS生成的調節(jié)[9]。關節(jié)滑膜細胞及其分泌的炎性細胞因子IL-1、IFN-γ、TNF-α在RA的滑膜炎癥持續(xù)進展、關節(jié)破壞中起重要作用[2]。但炎性細胞因子是否能刺激滑膜細胞產生NO和iNOS、NF-κB在滑膜細胞NO和iNOS生成中起何作用，目前尚不清楚。本實驗擬以人類滑膜成纖維細胞株MH7A作為載體，觀察這些炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激下NO及iNOS生成的變化，并探討NF-κB在NO和iNOS生成中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 人類滑膜成纖維細胞株MH7A購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，IL-1、IFN-γ、TNF-α均購自美國Sigma公司，NF-κB抑制劑BAY（型號：11-7082）購自美國MedChemExpress公司，SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒、逆轉錄試劑盒和Trizol提取RNA試劑盒均購自美國Applied Biosystems公司，NF-κB p-p65兔單克隆抗體和iNOS兔多克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH兔單克隆抗體和辣根酶標記的山羊抗兔IgG均購自美國Santa Cruz公司，NO測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購自美國Millipore公司，熒光二抗和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自南通碧云天生物科技公司，定量PCR試劑盒購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 滑膜成纖維細胞培養(yǎng)和傳代 滑膜成纖維細胞株MH7A復蘇后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3～4d換液1次。當細胞生長至融合時，用0.25%胰蛋白酶消化并按1∶3比例分瓶傳代，傳代后細胞加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組 在一階段實驗中，將細胞根據(jù)不同刺激時間分為 0、2、4、8、12、24h 6 組，并將 6 組的滑膜細胞分別用 IL-1（10ng/ml）、TNF-α（20ng/ml）和 IFN-γ（100U/ml）單獨刺激及聯(lián)合刺激。在二階段實驗中，先將滑膜細胞根據(jù)有無聯(lián)合刺激以及加入BAY的濃度不同分為正常組（C組）、聯(lián)合刺激組、聯(lián)合刺激+BAY（2.5）組、聯(lián)合刺激+BAY（5）組，后兩組是用 2.5或 5ng/ml BAY 進行預處理后，加入 IL-1（10ng/ml）、TNF-α（20ng/ml）和 IFN-γ（100U/ml）聯(lián)合刺激，通過觀察細胞質蛋白p-p65表達情況間接觀察NF-κB活化情況，從而篩選出BAY最佳抑制劑濃度。

1.2.3 細胞內p-p65和iNOS蛋白表達檢測 采用Western blot法。將分組處理后的滑膜細胞用PBS清洗后，加入含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析裂解液裂解30min，離心收集上清液，采用牛血清白蛋白定量法。將20μg蛋白樣品與6×十二烷基硫酸鈉（SDS）加樣緩沖液混合，煮沸5min。樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,經(jīng)電轉移法轉移到聚偏氟乙烯膜上，室溫下用含2%脫脂奶粉的封閉液封閉4h，分別加入p-p65兔單克隆抗體、iNOS兔多克隆抗體孵育2~4h，漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，反應1h。電化學發(fā)光底物檢測膜上的抗原-抗體復合物,置凝膠成像系統(tǒng)成像，分析灰度值。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參照物。

1.2.4 NF-κB核移位的檢測 采用細胞免疫熒光法。將培養(yǎng)瓶中各組滑膜細胞用胰酶消化后均勻接種于鋪有爬片的6孔板，待細胞長滿至細胞培養(yǎng)瓶的80%面積時給予相應處理一定時間，倒去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定1h，將配好的NF-κB p-p65兔單克隆抗體加入6孔板中，4℃過夜，用PBS清洗后加入的異硫氰酸熒光素標記的熒光二抗，室溫孵育2h。用PBS洗后加入DAPI染色5min（全程避光）。吸干凈后，在載玻片上滴加淬滅液，將爬片正面向下置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 細胞內iNOS mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。采用Trizol法提取各組細胞的總RNA。將提取后的RNA經(jīng)逆轉錄生成 cDNA，反應體系如下：RNA（1μg）、MMuLV2 逆轉錄酶（40U/μl）、多聚胸腺嘧啶（100nM）、脫氧核糖核苷三磷酸混合物（1mM）、二硫蘇糖醇（0.1M）、RNA 酶抑制物(40U/μl)、加焦碳酸二乙酯去離子水至總體積為20μl。反應條件如下：42℃ 60min，70℃10min。將生成的cDNA使用定量PCR試劑盒進行擴增，反應體系如下：0.4μM 模板、正、反義鏈各 1μl、12.5μl SYBR Green 酶、加去離子水至總體積 20μl。PCR反應程序如下：95℃ 5min預變性，然后按95℃ 15s，60℃1min共40個循環(huán)，最后72℃ 7min延伸。數(shù)據(jù)處理采用閾值循環(huán)（Ct）分析法，計算模板與對照樣本之間的 2-ΔΔCt值差。

1.2.6 細胞培養(yǎng)上清液中NO濃度變化的檢測 采用硝基還原酶法。各組滑膜細胞經(jīng)一定處理后，收集上清液。按NO測定試劑盒說明書所述加入樣本和試劑一，37℃水浴60min。加入試劑二，室溫孵育40min，3 500~4 000r/min，離心10min。取上清液0.5ml，加入顯色劑，靜置10min，550nm波長，1cm光徑，比色，得出結果。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Dunnet’t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激滑膜細胞p-p65、iNOS蛋白水平比較 IL-1刺激 4、8h及聯(lián)合刺激4h后細胞p-p65蛋白表達均增加，而IL-1刺激2、4h及聯(lián)合刺激4h后滑膜細胞iNOS蛋白表達均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1、2和圖1。

2.2 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激對NF-κB核移位的影響 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激4和8h后，滑膜細胞NF-κB核轉移明顯增加，見圖2。

2.3 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激對細胞iNOS mRNA水平的影響 IL-1刺激8、12h和TNF-α刺激2、8、12h以及INF-γ刺激2h及聯(lián)合刺激2、8、12和24h后，滑膜細胞iNOS mRNA表達均有所升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表 3。

2.4 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激對NO水平的影響3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激時NO水平均升高（均P＜0.05），但高峰期時間不一樣：IL-1最高峰為12h，TNF-α最高峰為8h，IFN-γ最高峰為4h，聯(lián)合刺激最高峰在2~4h，見表4。

2.5 NF-κB抑制劑BAY對滑膜細胞p-p65蛋白表達以及核轉移的影響 與C組表達水平0.71±0.04比較，聯(lián)合刺激組滑膜細胞p-p65蛋白的表達水平升高，為1.71±0.20（P＜0.05）；與聯(lián)合刺激組比較，聯(lián)合刺激+BAY（2.5）組為 0.91±0.04，聯(lián)合刺激+BAY（5）組為 0.68±0.02，兩組表達水平均下降（均P＜0.05），見圖3。細胞免疫熒光結果顯示，與C組比較，聯(lián)合刺激組滑膜細胞NF-κB核轉移明顯增加；與聯(lián)合刺激組比較，聯(lián)合刺激+BAY（2.5）組和聯(lián)合刺激+BAY（5）組滑膜細胞 NF-κB核轉移均明顯減少，見圖4。

2.6 3組滑膜細胞iNOS蛋白、mRNA和NO表達水平比較 與C組比較，聯(lián)合刺激組細胞iNOS蛋白、mRNA和NO表達水平均升高（均P＜0.05）；與聯(lián)合刺激組比較，聯(lián)合刺激+BAY（5）組iNOS蛋白、mRNA和NO表達水平均下降（均P＜0.05）。見表5和圖5。

3 討論

NO是一種生物活性自由基，與許多生理功能有關，包括血管張力控制、神經(jīng)傳導、線粒體功能、細胞凋亡和炎癥。一些研究表明，NO在許多自身免疫性炎癥反應的發(fā)病機制中均有參與。RA等疾病中會產生過量的NO導致血管翳、炎癥和關節(jié)破壞。iNOS是重要的促炎介質，能催化L-精氨酸生成NO，是NO生產過程中的關鍵酶。研究表明，iNOS在RA患者的滑膜和軟骨中高表達，并且滑膜成纖維細胞是RA關節(jié)滑膜中iNOS的主要來源，同時，NO水平與RA滑膜中iNOS陽性滑膜細胞的數(shù)量強相關，這表明iNOS參與RA滑膜關節(jié)中的NO過量產生[2]。研究表明，RA關節(jié)滑膜組織中的一些炎性細胞因子如IL-1、TNF-α和IFN-γ可能誘導了NO生成[10]。

本研究顯示，IL-1、IFN-γ、TNF-α 3 種炎癥因子單獨刺激滑膜細胞后NO與iNOS mRNA的表達均有升高趨勢，而且其所達到最高峰的時間點各不相同。而當本研究團隊將3種炎癥因子聯(lián)合進行刺激后，NO和iNOS表達均升高，特點是隨著刺激時間的不同，呈現(xiàn)了先增高后降低趨于正常的趨勢。

表1 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激滑膜細胞p-p65蛋白水平比較

表2 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激滑膜細胞iNOS蛋白水平比較

圖1 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激滑膜細胞p-p65、iNOS蛋白表達的電泳圖（a：p-p65；b：iNOS）

圖2 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激細胞NF-κB核移位熒光顯微鏡所見（DAPI染色，×200）

表3 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激細胞iNOS mRNA水平變化

表4 3種炎癥因子單獨或聯(lián)合刺激細胞培養(yǎng)上清液NO水平比較

圖3 4組滑膜細胞中p-p65蛋白表達的電泳圖

圖4 4組滑膜細胞中p-p65核移位熒光顯微鏡所見（DAPI染色，×200）

表5 3組滑膜細胞iNOS蛋白、mRNA和NO表達水平比較

圖5 3組滑膜細胞中iNOS蛋白表達的電泳圖

NF-κB通路作為在類風濕關節(jié)炎中發(fā)揮重要作用的信號通路之一，參與多種細胞因子的生成調節(jié)。有研究證實，IL-1、IFN-γ、TNF-α等炎癥因子聯(lián)合刺激巨噬細胞產生大量NO和iNOS表達，而NF-κB起基因轉錄的調節(jié)作用。本研究表明IL-1、IFN-γ、TNF-α單獨刺激或聯(lián)合刺激均能促進NF-κB活化，而NF-κB通路抑制劑BAY對于這3種炎癥因子聯(lián)合刺激所致滑膜細胞i－NOS和NO表達和生成顯著抑制，說明NF-κB介導滑膜細胞iNOS和NO生成，這一調控作用通過NF-κB核轉移來實現(xiàn)。但是，本研究結果可以看到與C組相比，抑制劑組的表達量仍舊較高，說明在滑膜細胞NO和iNOS生成的信號網(wǎng)絡中除了NF-κB這條通路之外，不排除其他的信號通路參與其中，共同參與滑膜細胞NO和iNOS生成的調節(jié)。

總之，滑膜細胞在 IL-1、IFN-γ、TNF-α 刺激下能誘導NF-κB入核并活化，NF-κB活化與NO和iNOS生成調節(jié)有關。至于NF-κB是直接調節(jié)轉錄，還是與其他轉錄因子相互作用共同參與對iNOS和NO生成的調節(jié)，還需進一步研究。