調(diào)脾護(hù)心方對(duì)慢性心力衰竭大鼠toll樣受體4及TNF-α表達(dá)的影響

付 軍，祝德偉2，戴小華，楊 帆，王銀燕，戚先偉

慢性心力衰竭是多種心血管疾病最終的歸宿，是由高血壓、冠心病、心臟瓣膜病等各種原因引起心臟負(fù)荷過(guò)重、心肌收縮力下降，導(dǎo)致心排血量不足引起一系列臨床癥狀和體征的復(fù)雜綜合征。相關(guān)調(diào)查顯示：我國(guó)慢性心力衰竭病人發(fā)病率高達(dá)0.9%，且隨著年齡不斷增加，發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重威脅人類的健康和生活質(zhì)量[1]。目前認(rèn)為心室重構(gòu)是慢性心力衰竭發(fā)生的基本機(jī)制，近年來(lái)隨著對(duì)慢性心力衰竭機(jī)制的不斷深入研究，炎性細(xì)胞因子在慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展中的作用引起學(xué)者關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)介導(dǎo)在心力衰竭中起到重要的作用，可激發(fā)炎癥因子釋放炎癥因子，加速心肌肥大及纖維化，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，引起心室重構(gòu)，從而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展[2]。本研究觀察調(diào)脾護(hù)心方對(duì)慢性心力衰竭大鼠toll樣受體4和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)的影響及光鏡下大鼠心肌細(xì)胞的變化情況，探討中藥調(diào)脾護(hù)心方對(duì)慢性心力衰竭大鼠炎癥因子的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇體重250～300 g周齡配對(duì)的SD雄性健康大鼠40只，所有大鼠均購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為對(duì)照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組和模型組，各8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 調(diào)脾護(hù)心方(顆粒劑)，組方：茯苓、陳皮、炙甘草、廣木香、酸棗仁、炙遠(yuǎn)志、白術(shù)、蒲公英等，為安徽省中醫(yī)院提供；培哚普利(施維雅制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20034053，規(guī)格：每片4 mg)；B型鈉尿肽(BNP)抗體(上海信裕生物工程有限公司)；toll樣受體4多克隆抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)；大鼠toll樣受體4免疫法試劑盒(R&D system 公司)，大鼠TNF-α免疫法試劑盒(R&D system 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 小動(dòng)物呼吸機(jī)(北京拜安吉科技有限公司)，心電圖機(jī)(上海 XDH-3B)，多導(dǎo)生理儀(Power Lab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，澳大利亞 ADInstruments 生產(chǎn))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模方法 左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法：40只SD雄性健康大鼠術(shù)前禁食8 h，之后采用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉，將大鼠頭部及四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，并用牙線固定牙齒，待大鼠呼吸平穩(wěn)后，行氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整通氣量(成功標(biāo)準(zhǔn)為吸呼比1∶2，呼吸頻率90次/min，潮氣量14 mL/kg)，標(biāo)記大鼠正常心電圖。完成后，充分暴露大鼠左前胸，常規(guī)剃毛、消毒后，沿胸骨左側(cè)第3、4肋間打開(kāi)大鼠胸腔，暴露大鼠心臟，之后使用無(wú)菌齒鑷輕提左心耳，暴露大鼠心臟主動(dòng)脈根部，帶線縫合針繞過(guò)冠狀動(dòng)脈(心上緣)結(jié)扎心肌組織2～3 mm，打兩個(gè)死結(jié)，以縫線下心肌顏色變淺變白，同時(shí)結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)為心電圖提示模型大鼠Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高(≥0.1 mV)[3]?？p合胸壁后，術(shù)后皮下注射青霉素8×105U，呋塞米20 mg，鹽酸利多卡因0.1 g預(yù)防感染及利尿，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后撤離呼吸機(jī)。將術(shù)后存活大鼠常規(guī)喂食及水4周。第28天用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后備皮，采用多導(dǎo)生理儀系統(tǒng)測(cè)量各組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)，具體操作：大鼠消毒備皮后，頭部及四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，分離右頸總動(dòng)脈，將多導(dǎo)生理記錄儀一端插入右頸總動(dòng)脈，之后進(jìn)一步接入左心室，另一端接入壓力換能器，之后同步記錄心電圖、LVEDP。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為[4]LVEDP>15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.4.2 給藥方法 中藥高劑量組以23.40 mg/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)給予調(diào)脾護(hù)心方顆粒劑灌胃，中藥低劑量組以5.85 mg/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)給予調(diào)脾護(hù)心方顆粒劑灌胃，西藥組以0.36 mg/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)給予培哚普利灌胃，模型組和對(duì)照組給予相同劑量生理鹽水灌胃。各組均給予相應(yīng)藥物灌胃4周。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法

1.5.1 心電圖 采用動(dòng)物心電圖機(jī)(型號(hào)為XD7100)于造模前后檢測(cè)并記錄所有大鼠心電圖。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BNP、TNF-α 灌胃前于大鼠眼眶后采集血液5 mL，加入抗凝管，以3 000 r/min離心5 min，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)生化分析方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 toll樣受體4蛋白檢測(cè) 灌胃4周后，打開(kāi)胸腔，取心室肌組織，將取出的心肌組織在抽提液中溶解，之后離心后收集上清液；將載有蛋白的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)通過(guò)轉(zhuǎn)膜方法放入到緩沖液中；取出PVDF后，放入到稀釋1∶1 000的一抗中，之后靜置整晚后，再洗膜3次，頻率為每10 min洗膜1次；稀釋辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗(羊抗鼠IgG)到工作濃度(1∶1000)，之后將膜置于二抗中，37%搖床孵育1 h；每10 min 1次，洗膜次數(shù)共5次。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)toll樣受體4蛋白表達(dá)。

1.5.4 免疫組化檢測(cè)TNF-α表達(dá) 取出水合氯醛麻醉后的心室心肌組織，采用4%多聚甲醛固定，時(shí)間24 h，脫水、石蠟包埋，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗切片脫蠟的心室心肌組織，采用檸檬酸高壓方式修復(fù)2min；PBS沖洗，經(jīng)過(guò)整晚時(shí)間后在TNF-α一抗(1︰200)基礎(chǔ)上，加二抗以37 ℃溫度孵育2 h，心室心肌組織通過(guò)蘇木素再次染色10 s后，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，之后通過(guò)Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析心室肌組織TNF-α表達(dá)。

1.5.5 心肌病理學(xué)觀察 灌胃結(jié)束后，采用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉，取出心室心肌組織，之后沿左心室長(zhǎng)軸橫斷面取厚度合適的數(shù)張切片(間隔為 1 mm)，厚度約4 μm，通過(guò)4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，所有標(biāo)本HE染色。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 手術(shù)過(guò)程或術(shù)后感染共4只大鼠死亡，其中中藥低劑量組1只，西藥組1只，模型組2只。除對(duì)照組外，其他各組大鼠均出現(xiàn)不等程度倦臥、脫毛、精神萎靡、納食減少、消瘦等癥狀；經(jīng)藥物治療后，大鼠上述癥狀均有不同程度改善，其中中藥高劑量組改善更顯著；與模型組比較，中藥低劑量組與西藥組大鼠上述狀態(tài)有所改善。

2.2 大鼠心電圖比較 模型大鼠Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高(≥0.1 mV)，提示急性心肌梗死大鼠造模成功。詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 造模前心電圖

圖2 造模后心電圖

2.3 各組大鼠心功能比較 與對(duì)照組比較，模型組和各給藥組大鼠LVEDP均>15 mmHg，且差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，提示慢性心力衰竭模型造模成功。與對(duì)照組比較，模型組和各給藥組大鼠BNP明顯偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支可建立慢性心力衰竭大鼠模型。詳見(jiàn)表1。

組別只數(shù)LVEDP(mmHg)BNP(ng/mL)對(duì)照組 8 8.69±1.13123.58±15.41 模型組 6 17.83±1.651)730.13±23.151)西藥組 7 18.57±2.451) 702.29±63.131)中藥低劑量組 7 17.92±1.591) 649.13±27.831)中藥高劑量組 8 16.07±0.951) 670.85±36.301)

與對(duì)照組比較，1)P<0.05

2.4 各組大鼠toll樣受體4水平比較 模型組大鼠心肌toll樣受體4蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組心肌toll樣受體4蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥低劑量組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2、圖3。

組別 只數(shù)toll樣受體4對(duì)照組 80.28±0.07模型組 61.31±0.071)西藥組 7 0.56±0.052)中藥低劑量組 7 0.81±0.082)3)中藥高劑量組 8 0.58±0.062)

與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

1為對(duì)照組；2為模型組；3為中藥低劑量組；4為中藥高劑量組；5為西藥組

圖3各組toll樣受體4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組大鼠心肌組織TNF-α水平比較 免疫組化染色后，模型組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)TNF-α蛋白陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色，各治療組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)減少，尤以中藥高劑量組、西藥組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)明顯，詳見(jiàn)圖4。模型組大鼠心肌TNF-α表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組心肌TNF-α表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥低劑量組與西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)TNF-α表達(dá)情況

組別 只數(shù) TNF-α 對(duì)照組867.96±9.01模型組 6286.49±28.791)西藥組7138.73±18.012)中藥低劑量組 7216.72±13.452)3)中藥高劑量組 8141.73±17.702)

與對(duì)照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

2.6 各組大鼠心肌細(xì)胞病理圖像 對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維未見(jiàn)增粗，未見(jiàn)水腫、壞死；模型組心肌纖維粗大、水腫及壞死、心肌細(xì)胞排列紊亂；中藥高劑量組與西藥組心肌細(xì)胞改善情況比較，無(wú)顯著差異；中藥低劑量組心肌纖維改善明顯，心肌細(xì)胞排列緊密。詳見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠心肌細(xì)胞病理圖像

3 討 論

相關(guān)研究表明，各種炎性因子激活與慢性心力衰竭密切相關(guān)，它們?cè)谛牧λソ叩陌l(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。toll樣受體4蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與心血管疾病相關(guān)的天然免疫受體，主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌和產(chǎn)生，在人體內(nèi)多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，介導(dǎo)天然免疫的跨膜信號(hào)傳遞受體[6]，toll樣受體4可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞炎癥狀態(tài)，參與心肌炎、心肌梗死后、心力衰竭等心血管疾病發(fā)生[7]。有研究表明，包括冠心病在內(nèi)的缺血性心臟病均存在toll樣受體4分子表達(dá)上調(diào)，而這種增高與疾病嚴(yán)重程度及炎性介質(zhì)TNF-α、白介素6(IL-6)相關(guān)[8]，且心功能越差者，toll樣受體4表達(dá)越高[9]。toll樣受體4可激活心肌細(xì)胞內(nèi)的核因子-κB，可使核因子-κB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，從而引起IL-6、TNF-α等炎癥因子表達(dá)升高。炎性物質(zhì)浸潤(rùn)，使心肌實(shí)質(zhì)減少，纖維組織增多，從而導(dǎo)致心室重構(gòu)及心力衰竭的形成[10]。

TNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞生成，目前越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)TNF-α是慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中重要的影響因素，可反映慢性心力衰竭的嚴(yán)重程度。TNF-α對(duì)心肌具有負(fù)性肌力作用，可加速心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心室重塑，且TNF-α水平越高，慢性心力衰竭嚴(yán)重程度和病人病死率越高[11]。TNF-α通過(guò)抑制肌漿網(wǎng)Ca2+泵，參與左心室重塑和心肌纖維化過(guò)程從而使其功能喪失[12]；通過(guò)激活多個(gè)細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)心室重塑，促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)慢性心力衰竭的發(fā)生[13]；刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶生成一氧化氮，損傷心肌細(xì)胞，抑制心肌收縮力，從而導(dǎo)致心力衰竭[14]。

調(diào)脾護(hù)心方由戴小華主任根據(jù)歸脾湯及酸棗仁湯化裁而成，主要由茯苓、陳皮、白術(shù)、炙甘草、廣木香、酸棗仁、炙遠(yuǎn)志、蒲公英等藥物組成，具有健脾益氣、養(yǎng)心安神之功效。臨床治療慢性心力衰竭過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其能減輕臨床癥狀，改善病人心功能及預(yù)后[15]。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)脾護(hù)心方可明顯降低血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性，并可相應(yīng)降低BNP、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等[16]。本研究結(jié)果顯示，調(diào)脾護(hù)心方能改善大鼠慢性心力衰竭心功能，減輕臨床癥狀，其機(jī)制與抑制慢性心力衰竭炎癥狀態(tài)有關(guān)，抗炎作用與培哚普利相當(dāng)，同時(shí)為調(diào)脾護(hù)心法改善慢性心力衰竭炎癥狀態(tài)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。