毛竹 Phyllostachys edulis retrotransposon 7（PHRE7）轉(zhuǎn)座子的克隆與鑒定

蔣政勤，周明兵,2，鄭 浩，季 航，徐芷馨

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省竹資源與高效利用協(xié)同中心，浙江 杭州311300）

毛竹Phyllostachys edulis為禾本科Gramineae剛竹屬Phyllostachys下的一個(gè)種，在中國竹產(chǎn)業(yè)中有十分重要的地位。轉(zhuǎn)座子是真核生物中一類重要的轉(zhuǎn)座元件，在毛竹基因組中有廣泛分布。轉(zhuǎn)座子又可稱跳躍因子，其實(shí)質(zhì)是基因組染色體上能自主復(fù)制和位移的一段脫氧核糖核酸（DNA）序列，可以直接從基因組內(nèi)的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)［1］，其轉(zhuǎn)座的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致自身堿基位置的改變和（或）拷貝數(shù)的增加。轉(zhuǎn)座子根據(jù)轉(zhuǎn)座方式不同可分為DNA轉(zhuǎn)座子（DNA transposon）和核糖核酸（RNA）反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）。DNA轉(zhuǎn)座子是以DNA為中間媒介，通過 “剪切—粘貼”的方式移動(dòng)，最早在玉米Zea mays中發(fā)現(xiàn)［2］。RNA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是以RNA為中間媒介，依賴于反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄成DNA后，通過 “復(fù)制—粘貼”的方式移動(dòng)，于1984年在玉米中首先被發(fā)現(xiàn)［3］。RNA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子又在酵母和動(dòng)物基因組中被發(fā)現(xiàn)，后被證實(shí)在植物基因組中廣泛存在［4］。例如在小麥Triticum aestivum基因組中轉(zhuǎn)座子高達(dá)60%［5］，玉米基因組中轉(zhuǎn)座子比例高達(dá)85%［6］。RNA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子根據(jù)其結(jié)構(gòu)又可以分為長末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR）和非長末端重復(fù)序列（non-LTRs）［7］。 其中含有長末端重復(fù)序列的 LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是目前研究較多的一類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，幾乎在所有高等植物基因組中都有分布［8］，對(duì)植物基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化有重要的作用。一個(gè)結(jié)構(gòu)完整的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子長度通常為2～18 kb，兩端各有1個(gè)長度為100～5000 bp序列同源的長末端重復(fù)序列LTRs。LTR末端為反向重復(fù)序列，結(jié)構(gòu)通常為 5′-TG-3′和 5′-CA-3′， 在 5′和 3′末端兩側(cè)通常具有 4～6 bp 的末端靶位點(diǎn)重復(fù)序列（target site duplications，TSDs）［9］。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子除兩端的反向重復(fù)的長末端重復(fù)序列外，其結(jié)構(gòu)組成還包括引物結(jié)合位點(diǎn)（primer binding site，PBS），多嘌呤序列（polypurinetract，PPT），還有與轉(zhuǎn)座機(jī)制有關(guān)的GAG（gag protein）開放閱讀框和POL（polymerase）開放閱讀框。目前，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)錄活性的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，根據(jù)對(duì)活性的LTR轉(zhuǎn)座子序列、進(jìn)化關(guān)系和結(jié)構(gòu)特征的分析，發(fā)現(xiàn)活性LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在結(jié)構(gòu)上具有相似性［10］：均含有2個(gè) LTR區(qū)域、gag基因區(qū)、pol基因區(qū)（pr，int，rt，rh）；LTR區(qū)具有1個(gè)或多個(gè)順式調(diào)控元件；各個(gè)結(jié)構(gòu)域均具有相應(yīng)的關(guān)鍵保守氨基酸。根據(jù)轉(zhuǎn)座子的長度、LTR的長度和物種分布，植物中的Ty1/Copia類轉(zhuǎn)座子可分為4種類型，分別為Tork，Retrofit，Oryco和 Sire； Ty3/Gypsy類轉(zhuǎn)座子可分為 6 種類型， 分別為 Tat， Athila， CRM， Reina， Del和 Galadriel［11］。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是宿主染色體結(jié)構(gòu)變異和基因組進(jìn)化的重要調(diào)控因子［12］，與植物性狀穩(wěn)定表達(dá)有關(guān)。在正常的生長環(huán)境條件下，多數(shù)LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不表達(dá)，呈靜止?fàn)顟B(tài)存在，在受到逆境脅迫或DNA甲基化水平波動(dòng)劇烈的情況下會(huì)被激活轉(zhuǎn)座，調(diào)節(jié)植物抗逆基因的表達(dá)，從而發(fā)揮遺傳可塑性來適應(yīng)不同環(huán)境條件。例如，云南地方水稻Oryza sativa品種 ‘月亮谷’ ‘Yuelianggu’（傳統(tǒng)品種，Acuche）的幼苗在高鹽處理后，檢測3個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下，3個(gè)基因都被誘導(dǎo)快速轉(zhuǎn)錄，表達(dá)量均明顯增加［9］；陸地棉Gossypium hirsutum品系 ‘棕彩選1號(hào)’ ‘Zongcaixuan No.1’在低溫脅迫下，抵御低溫起關(guān)鍵作用的T10和T18轉(zhuǎn)座子在低溫脅迫后均呈上調(diào)表達(dá)［13］，禾本科單子葉植物高羊茅Festuca arundinacea在干旱脅迫下，它們的甲基化程度增加，干旱誘導(dǎo)T10和T18轉(zhuǎn)座子甲基化。DNA甲基化會(huì)抑制轉(zhuǎn)座子的活性［14］。所以當(dāng)植物受到非生物環(huán)境脅迫時(shí)，例如在高溫、低溫、高鹽、輻照等逆境條件下，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子會(huì)被激活并插入到目的基因中進(jìn)行轉(zhuǎn)座，影響周邊基因的表達(dá)模式和表達(dá)量［15］，幫助植物適應(yīng)不同的逆境脅迫。毛竹全基因組序列分析表明：LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在毛竹基因組含量最豐富，占整個(gè)基因組的37.3%（Ty1-copia，12.3%；Ty3-gypsy，24.6%）［16］。為探究毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在毛竹生長受到逆境脅迫時(shí)的響應(yīng)模式，本研究在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中，選取1條具有完整結(jié)構(gòu)的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，命名為PHRE7，對(duì)PHRE7轉(zhuǎn)座子進(jìn)行克隆與鑒定，系統(tǒng)分析了PHRE7在脅迫下的表達(dá)模式。本研究結(jié)果將為系統(tǒng)闡明LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子非生物脅迫下的響應(yīng)機(jī)制及揭示毛竹對(duì)環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料：毛竹幼葉、竹筍、竹根取自浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的翠竹園，樣竹長勢良好。毛竹實(shí)生苗均由同一株毛竹種子培育而來。毛竹種子均取自廣西省靈川同一株開花毛竹，為大小基本一致的飽滿種子。

實(shí)驗(yàn)試劑：用于提取RNA的RNA Trizol試劑，克隆PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的pMD18-T克隆載體，LATaq酶等聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑及RNA的反轉(zhuǎn)錄所需的Prime ScriptTMRT Master Mix和SYBRPremix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料處理

從同株毛竹上采集飽滿且大小基本一致的優(yōu)質(zhì)種子，分別進(jìn)行輻照、甲基化抑制劑、高溫、低溫、高鹽等5種不同的處理，并留空白對(duì)照。

空白對(duì)照組種子處理：先用無菌水清洗種子，后用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇浸泡消毒30 s，再用無菌水沖洗3次，然后在無菌水中浸泡24 h以恢復(fù)種子活力。取無菌培養(yǎng)皿，放入無菌濾紙后用無菌水潤濕，再用鑷子輕夾出毛竹種子，置于濾紙上靜待萌發(fā)。待長至3～4片葉后（2～3周）將其轉(zhuǎn)移至m（珍珠巖）∶m（蛭石）∶m（泥炭土）=1∶1∶1 的基質(zhì)中生長。

輻照處理：挑選優(yōu)質(zhì)野生型毛竹種子450粒，150粒·組-1，分別接受 30，50和70 Gy等3個(gè)梯度的137Cs-γ射線輻照，輻照地點(diǎn)為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所輻照中心，做好不同梯度的標(biāo)記，后續(xù)與不做任何處理的空白對(duì)照組在相同條件下培育到長出5片葉［17］。

甲基化抑制劑處理：毛竹種子分別用50.0，150.0和250.0 μmol·L-1的5-氮雜胞苷浸種24 h，種子數(shù)量同輻照處理一致，即每梯度150粒，但在5-氮雜胞苷處理前需用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次進(jìn)行消毒處理。隨后與空白對(duì)照組在相同條件下培育。

高溫和低溫處理：前面階段與對(duì)照組的培育方法相同，待毛竹實(shí)生苗長出3～4片葉后，分別在培養(yǎng)箱進(jìn)行高溫42℃處理4 h和低溫4℃處理16 h，每處理選取生長狀況良好毛竹幼苗10株，后續(xù)處理與空白對(duì)照組相同。

高鹽處理：前面階段與對(duì)照組的培育方法相同，待毛竹實(shí)生苗長出3～4片葉后，分別用0.1，0.2和0.3 mol·L-1氯化鈉溶液100 mL澆灌3 d［18-19］，每處理選取生長狀況良好毛竹幼苗10株，后續(xù)處理與空白對(duì)照組相同。

采集空白對(duì)照組及5種脅迫處理下的毛竹實(shí)生苗的葉片，每處理重復(fù)3株，用液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子克隆 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法從毛竹嫩葉中提取毛竹基因組DNA［20］，根據(jù)PHRE7的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)1對(duì)克隆引物（PHRE7-F和PHRE7-R，具體序列見表1）。以毛竹提取DNA作為克隆模板，運(yùn)用以上設(shè)計(jì)的克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體擴(kuò)增反應(yīng)體系設(shè)計(jì)為：LATaq酶 0.5 μL，PHRE7-F 和PHRE7-R 各 0.8 μL，2×GC 緩沖液（buffer）25.0 μL ， 三磷酸堿基脫氧核苷酸混合液（dNTP mix）4.0 μL，DNA 100 ng，加無菌水補(bǔ)齊50.0 μL。具體反應(yīng)條件設(shè)計(jì)為：預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃30 s，退火44℃30 s，延伸72℃5 min，35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖電泳中分離，PCR產(chǎn)物連接到pMD20-T克隆載體上，膠回收目的片段并送生物公司測序。

1.3.2PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼域的相對(duì)表達(dá)量分析 分別提取毛竹未經(jīng)處理葉片以及甲基化抑制劑、輻照、高溫、低溫、高鹽等5種脅迫處理后實(shí)生苗葉片的RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，具體方法參照Trizol法［21］。在RT，INT，RH序列3個(gè)可編碼蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)分別設(shè)計(jì)特異性引物（表1），對(duì)PHRE7的表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，內(nèi)參基因?yàn)槊馪heACT2［22］。熒光定量反應(yīng)體系設(shè)計(jì)為 10.0 μL： 5.0 μL SYBRPremix ExTaqTMⅡ，0.4 μL cDNA，0.2 μL 底物-5（primer-5）， 0.2 μL primer-3，4.2 μL無菌水［23］。反應(yīng)條件如下：95℃ 7 min； 預(yù)擴(kuò)增95℃ 10 s，58℃10 s，72℃15 s，共30個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，按照2-ΔΔt的方法計(jì)算出不同脅迫處理?xiàng)l件下PHRE7的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.3.3PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)分析 下載毛竹基因組數(shù)據(jù)，通過LTRharvest軟件［24］（http://www.zbh.uni-hamburg.de/forschung/genominformatik/software/ltrharvest.html）對(duì)LTR轉(zhuǎn)座子的長度、序列等進(jìn)行分析，鑒定毛竹基因組LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，再利用LTRdigestion軟件［25］（http://www.zbh.uni-hamburg.de/forschung/genominformatik/software/ltrdigest.html），解析毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)并完成自動(dòng)標(biāo)注，通過cd-hit軟件［26］構(gòu)建序列相似的非冗余基因集，分析各序列的相似程度，確定毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)。根據(jù)毛竹LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝以及轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，選取1個(gè)結(jié)構(gòu)完整的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子作為研究對(duì)象，將其命名為PHRE7。PHRE7各個(gè)結(jié)構(gòu)域由LTRdigestion軟件鑒定，由編碼區(qū)序列翻譯的氨基酸序列提交到非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（NCBI），通過blastp進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，并由此建立PHRE7的結(jié)構(gòu)圖。

1.3.4PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入時(shí)間分析 將PHRE7的LTR序列輸入MEGA7軟件［27］，通過Muscle方法比對(duì)PHRE7轉(zhuǎn)座子兩端LTR序列的同源性，計(jì)算得分化度k。根據(jù)公式t=k/2r［28］（t為插入時(shí)間，r為LTR 序列的平均替換率，1.3×10-8bp·a-1［29］），計(jì)算得PHRE7 插入時(shí)間。

1.3.5PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列分析 通過克隆結(jié)果測序與該序列比對(duì)，確定序列完全一致性，明確開放性閱讀框中的各蛋白編碼區(qū)（PR，INT，RT，RH等）的位置。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的5′端LTR的U3區(qū)域都有豐富的順式調(diào)控元件。為了分析鑒定轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域中順式調(diào)控元件的種類和分布情況，將LTR區(qū)域編碼序列放入PlantCARE在線軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［30］中，直接分析得出該區(qū)域內(nèi)的各個(gè)順式作用元件并作出標(biāo)記。

1.3.6PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)化地位分析 利用Gypsy Database 2.0（http://www.gydb.org/index.php/Main_Page）查找并下載Ty1-copia家族其他成員（Oryco，Sire，Retrofit，Tork）的代表性反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列，與PHRE7轉(zhuǎn)座子的RT氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA7軟件中的Muscle方法進(jìn)行同源比對(duì)［31］，找出最佳模型，并通過該軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建進(jìn)化樹［32］，分析PHRE7所在的Ty1-copia家族亞家族位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHRE7的克隆

以毛竹DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增PHRE7轉(zhuǎn)座子，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收目的片段，送生物工程公司測序。電泳檢測結(jié)果顯示PHRE7轉(zhuǎn)座子與預(yù)測的大?。?073 bp）基本一致（圖1）。

圖1 全長PHRE7轉(zhuǎn)座子PCR擴(kuò)增電泳圖Figure 1 PCR result of full-length PHRE7

2.2 基因的序列分析

2.2.1PHRE7結(jié)構(gòu)特征PHRE7轉(zhuǎn)座子全長為6073 bp，測序結(jié)果與預(yù)測一致。PHRE7轉(zhuǎn)座子組成為5′端和3′端的長末端重復(fù)序列和含5種酶的連續(xù)開放閱讀框（ORF），結(jié)構(gòu)順序依次為5′-L-LTR-GAG-PRINT-RT-RH-LTR-R-3′（圖2）。各結(jié)構(gòu)長度具體如下：左端LTR（L-LTR）長度為959 bp，右端LTR（LTR-R）為3′端LTR的反向重復(fù)序列，長度也為959 bp，相似性為96.7%。計(jì)算得插入時(shí)間約為126.92萬a前。開放閱讀框核苷酸編碼區(qū)總長度為1524 bp，共編碼氨基酸507個(gè)，GAG核心區(qū)位置在1030～1744 bp，主要與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RNA的成熟和包裝有關(guān)；PR核心區(qū)為是水解酶的編碼區(qū)，位置在1978～2224 bp，與反轉(zhuǎn)錄后多聚蛋白前體切割為功能性多肽有關(guān)；INT核心區(qū)是整合酶的編碼區(qū)，位置在2365～3004 bp，用于催化反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入宿主基因組的整個(gè)過程［33］；RT核心區(qū)是反轉(zhuǎn)錄酶的編碼區(qū)，位置在3580～4312 bp，用于催化單鏈RNA或DNA合成DNA的過程，是轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的必不可少的酶；RH核心區(qū)位置在4624～5020 bp，用于編碼核糖核酸酶H。核糖核酸酶H是水解酶的一種，負(fù)責(zé)原始RNA模板的水解。根據(jù)編碼區(qū)結(jié)構(gòu)順序GAG-PR-INT-RT-RH，可確定PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是Ty1-gypsy家族成員。通過cd-hit軟件［26］對(duì)比毛竹基因組中的轉(zhuǎn)座子，鑒定出PHRE7相似的序列，即其拷貝。結(jié)果顯示：PHRE7存在相似的其他10個(gè)拷貝，根據(jù)拷貝位置不同，分別把10個(gè)拷貝命名（表2）為PHRE7-1，PHRE7-2，PHRE7-3，PHRE7-4，PHRE7-5，PHRE7-6，PHRE7-7，PHRE7-8，PHRE7-9和PHRE7-10，10個(gè)拷貝的結(jié)構(gòu)也相對(duì)完整（圖2）。

圖2 毛竹基因組中PHRE7及其10個(gè)拷貝的結(jié)構(gòu)分析示意圖Figure 2 Structure of the PHRE7 and its copies in Phllostachys edulis genome

表2 PHRE7及其拷貝在毛竹基因組的命名及位置Table 2 Names and locations of PHRE7 and its copy in the Phyllostachys edulis genome

2.2.2PHRE7轉(zhuǎn)座子LTR序列分析 在LTR序列中，順式作用元件含量豐富。經(jīng)分析得，核心啟動(dòng)元件有TATA-box，CAAT-box，CCAAT-box，其中TATA-box有6個(gè)，CAAT-box有21個(gè)，CCAAT-box有2個(gè)，除啟動(dòng)子元件外還有 2個(gè)光響應(yīng)元件（4cl-CMA2b和chs-CMA2b），2個(gè)與脫落酸相關(guān)的調(diào)控元件（ABRE），3個(gè)壓力響應(yīng)元件（SIRE），1個(gè)參與蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式作用元件（O2-site）（圖3）。對(duì)毛竹基因組中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子PHRE7及其10個(gè)拷貝的插入時(shí)間進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：PHRE7的插入時(shí)間為126.92萬a前，PHRE7-1拷貝插入時(shí)間為223.08萬a前，PHRE7-2拷貝插入時(shí)間為150.00萬a前，PHRE7-3插入時(shí)間為142.31萬a前，PHRE7-4插入時(shí)間為261.54萬a前，PHRE7-5插入時(shí)間為126.92萬a前，PHRE7-6插入時(shí)間為403.85萬a前，PHRE7-7插入時(shí)間為442.31萬a前，PHRE7-8插入時(shí)間為238.46萬a前，PHRE7-9插入時(shí)間為219.23萬a前，PHRE7-10插入時(shí)間為307.69萬a前。經(jīng)計(jì)算可知：在這11個(gè)序列中，PHRE7與PHRE7-5的插入時(shí)間相同，為126.92萬a前，在11個(gè)序列中插入時(shí)間最晚，說明PHRE7是其中結(jié)構(gòu)完整且最為年輕的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（圖4）。

2.2.3PHRE7轉(zhuǎn)座子進(jìn)化分析 為了探究PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和植物中其他LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的進(jìn)化關(guān)系，利用保守性最高RT區(qū)域編碼序列構(gòu)建了PHRE7和其他植物典型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)化樹［34］。根據(jù)進(jìn)化樹（圖5）可知：PHRE7屬于Ty1-copia家族中4個(gè)分支（Oryco，Sire，Retrofit，Tork）的Tork分支。

2.3 PHRE7在不同處理中的表達(dá)模式分析

圖3 PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列順式元件分析Figure 3 Analysis of the cis-regulatory motifs in PHRE7

為分析PHRE7的組織表達(dá)模式，在PHRE7轉(zhuǎn)座子6個(gè)結(jié)構(gòu)域中選擇INT，RT，RH等3個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行表達(dá)量分析。PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT，RH，INT等3個(gè)結(jié)構(gòu)域在毛竹竹根、竹葉、竹筍等3個(gè)不同部位中均有表達(dá)，且在葉中相對(duì)表達(dá)量最大，在竹筍和根相對(duì)表達(dá)豐度依次降低（圖6）。

圖4 PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及各個(gè)拷貝的插入時(shí)間Figure 4 Insertion time of PHRE7 and its copies

圖5 PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of PHRE7 and other plant retrotransposons

圖6 PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子INT，RT， RH等3個(gè)結(jié)構(gòu)域在毛竹竹筍、竹根、竹葉中的表達(dá)量Figure 6 Expression levels of INT,RT and RH domains of PHRE7 in root,shoot and leaf of Phyllostachys edulis

PHRE73個(gè)結(jié)構(gòu)域（INT，RT，RH）在竹根、竹葉、竹筍不同部位的表達(dá)量上有差異，竹葉中的表達(dá)量均為最高。為了探討不同非生物環(huán)境脅迫條件對(duì)PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)的影響，研究通過定量熒光PCR對(duì)經(jīng)過不同處理（輻照、甲基化抑制劑、高/低溫、高鹽）的毛竹實(shí)生苗葉片中PHRE7轉(zhuǎn)座子的3個(gè)結(jié)構(gòu)域（INT，RT，RH）表達(dá)進(jìn)行了定量檢測和分析。

在0.1，0.2，0.3 mol·L-1高鹽處理后，高鹽脅迫下PHRE7的RT，RH和INT等3個(gè)結(jié)構(gòu)域表達(dá)量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在0.1～0.2 mol·L-1時(shí)呈上升趨勢， 0.2 mol·L-1左右各結(jié)構(gòu)域達(dá)到表達(dá)量最高值，0.2～0.3 mol·L-1表達(dá)量逐漸下降。3個(gè)結(jié)構(gòu)域中INT結(jié)構(gòu)域表達(dá)量變化幅度較大，RT和RH結(jié)構(gòu)域表達(dá)量相對(duì)較接近，且變化幅度相對(duì)較?。▓D7A）。

經(jīng) 50.0， 100.0， 150.0 μmol·L-1濃度甲基化抑制劑處理， 各結(jié)構(gòu)域的相對(duì)表達(dá)量隨甲基化抑制劑濃度的增大逐漸升高。50.0 μmol·L-1處理組相對(duì)空白對(duì)照組表達(dá)量顯著提升， 100.0 μmol·L-1與 150.0 μmol·L-1分別與前一甲基化抑制劑濃度處理組相比，表達(dá)量也均有上升。3個(gè)結(jié)構(gòu)域中INT表達(dá)量最高，RT結(jié)構(gòu)域表達(dá)量升高幅度比 INT?。▓D7B）。

不同強(qiáng)度的輻照脅迫下，INT，RT，RH等3個(gè)結(jié)構(gòu)域表達(dá)量均高于對(duì)照組。在30 Gy輻照強(qiáng)度下，各結(jié)構(gòu)域表達(dá)量達(dá)最大值，后隨著輻照強(qiáng)度的增加，各結(jié)構(gòu)域表達(dá)量呈下降趨勢。INT結(jié)構(gòu)域中30 Gy輻照處理后的表達(dá)量與50 Gy輻照處理后的表達(dá)量比值接近于2，RH和RT結(jié)構(gòu)域在50 Gy或70 Gy輻照強(qiáng)度處理下表達(dá)量均相近，INT結(jié)構(gòu)域相對(duì)表達(dá)量與RH和RT結(jié)構(gòu)域相比下降幅度最大（圖7C）。

4℃低溫和42℃高溫脅迫處理后，PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的INT，RT，RH等3個(gè)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)量均有提高，且高溫處理對(duì)表達(dá)量影響更大，上升更為顯著，表達(dá)量約為低溫處理的1.5倍。RT和INT結(jié)構(gòu)域表達(dá)量上升幅度高于RH（圖7D）。

3 討論

PHRE7是1條結(jié)構(gòu)完整的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，按照結(jié)構(gòu)域排列順序鑒定屬于Ty1-copia分支，具備轉(zhuǎn)座所需的所有酶和相似度極高的長末端重復(fù)序列（96.7%）。PHRE7的LTR中含有豐富的順式作用元件，在外界的非生物環(huán)境的脅迫下可能會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子激活進(jìn)行轉(zhuǎn)座。PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入時(shí)間為126.92萬a前，在植物基因中，很多五六百萬年前插入的轉(zhuǎn)座子仍存在活性，例如水稻愈傷組織中的Tos17反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入時(shí)間約在700萬a前，現(xiàn)仍能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)座［35］。相比而言PHRE7較為年輕，故推測其是仍具有轉(zhuǎn)錄活性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。

圖7 不同處理?xiàng)l件下PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子INT，RT，RH等3個(gè)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)量Figurte 7 Expression levels of the INT,RT and RH domains of PHRE7 under different treatments

PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各結(jié)構(gòu)域完整，該轉(zhuǎn)座子其他拷貝存在不同結(jié)構(gòu)域間的缺失。轉(zhuǎn)座致使宿主基因組出現(xiàn)斷裂和重排的現(xiàn)象，還會(huì)影響宿主基因表達(dá)，導(dǎo)致宿主基因組處于不穩(wěn)定的狀態(tài)。以上現(xiàn)象會(huì)激活宿主對(duì)LTR轉(zhuǎn)座子活性抑制機(jī)制，導(dǎo)致LTR轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化發(fā)展過程中，各結(jié)構(gòu)域間出現(xiàn)基因片段丟失現(xiàn)象，控制該轉(zhuǎn)座子的自主轉(zhuǎn)座。所以，PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及其10條拷貝可能是由共同祖先演化變異而來，而PHRE7反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在宿主基因調(diào)節(jié)機(jī)制下依然保持其完整的結(jié)構(gòu)。

PHRE7在毛竹各部位的表達(dá)存在差異性。在毛竹竹筍、竹根和竹葉等3個(gè)不同部位表達(dá)量對(duì)比中，PHRE7在竹葉中的表達(dá)量相對(duì)較高。有研究證明：活性LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在不同部位間的表達(dá)具有選擇性和特異性，可能與LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子長末端重復(fù)序列中的順式作用元件和其他元件的存在有關(guān)，各類元件與調(diào)控物質(zhì)的作用不同，對(duì)LTR轉(zhuǎn)座子的表達(dá)量也存在一定影響。

毛竹實(shí)生苗在甲基化抑制劑、輻照、高鹽、高溫和低溫等5個(gè)不同處理后，3個(gè)結(jié)構(gòu)域表達(dá)量均比對(duì)照高，表明PHRE7是1個(gè)具有轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)錄活性受外界環(huán)境變化的影響。

LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性與其甲基化程度有較大程度的關(guān)聯(lián)。通常情況下DNA甲基化可以作為基因沉默的一種表觀遺傳標(biāo)記［36］。在毛竹基因組中，編碼區(qū)占比較小，非編碼DNA序列［37］大量存在。為保證基因表達(dá)的準(zhǔn)確性，植物體要盡可能減少非編碼區(qū)基因?qū)D(zhuǎn)錄過程的干擾，因此在正常條件下，非編碼區(qū)DNA較少或基本不表達(dá)。而在甲基化抑制劑作用下，許多存在于非編碼區(qū)的轉(zhuǎn)座子會(huì)通過去甲基化作用解除限制使非編碼DNA得以激活表達(dá)［38］，因此發(fā)生甲基化抑制劑作用下各結(jié)構(gòu)域表達(dá)量顯著上調(diào)現(xiàn)象，且甲基化抑制劑的濃度越高，表達(dá)量越高，呈正相關(guān)。

逆境脅迫致使毛竹體內(nèi)的激素水平、離子水平和甲基化水平等都發(fā)生一定程度的變化，從而影響轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性［39］，引起表達(dá)量的變化，這也是LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對(duì)逆境做出的一種適應(yīng)［40］。輻射能引起植物變異。本研究結(jié)果顯示：輻照條件下，PHRE7轉(zhuǎn)座子表達(dá)量比空白對(duì)照組要高，但是隨輻照強(qiáng)度的增強(qiáng)表達(dá)量發(fā)生下調(diào)，其可能原因是高輻射對(duì)毛竹實(shí)生苗造成不可恢復(fù)的傷害，致使毛竹的自身調(diào)節(jié)功能不足以抵御外界輻照的傷害，各結(jié)構(gòu)域表達(dá)量隨輻照強(qiáng)度的增強(qiáng)而下降。

在高鹽脅迫下，植物體內(nèi)含水量會(huì)下降，水分過低會(huì)引起植物代謝和光合作用異常［41］。PHRE7的LTR序列中存在光響應(yīng)元件（4cl-CMA2b和chs-CMA2b），表明PHRE7轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄可能受光合作用調(diào)節(jié)。在高鹽作用下，PHRE7表達(dá)量隨鹽濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。其可能原因是鹽濃度提升致使毛竹實(shí)生苗光合作用異常［42］，轉(zhuǎn)座子得以激活表達(dá)，PHRE7結(jié)構(gòu)域表達(dá)量升高。

PHRE7在4℃低溫和42℃高溫處理下，表達(dá)量較對(duì)照組均有上調(diào)，且42℃較4℃更為顯著。溫度脅迫是植物中常發(fā)生的脅迫類型，溫度對(duì)催化各類植物生理活動(dòng)的酶活性有顯著影響，但極端溫度脅迫會(huì)造成基因組甲基化水平下降。在此效應(yīng)下，PHRE7結(jié)構(gòu)域的表達(dá)量呈上調(diào)變化。

本研究對(duì)毛竹反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子PHRE7的序列、結(jié)構(gòu)以及在典型非生物環(huán)境脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)PHRE7的表達(dá)量會(huì)在環(huán)境影響下有所變化，能對(duì)外界環(huán)境脅迫做出響應(yīng)，是具有轉(zhuǎn)錄活性的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，但具體的響應(yīng)機(jī)制尚未清楚，仍需進(jìn)一步的研究。