去除黃曲霉毒素的菌種篩選及其去除特性研究

段素云， 孫 健， 劉耀華，艾君濤，楊新建*

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，北京房山 102442；2.中國農(nóng)業(yè)大學出版社，北京海淀 100094）

2013—2017年，我國每年花生產(chǎn)量為1700萬噸左右，約占全球花生總產(chǎn)量的40%?；ㄉ墒敲摎せㄉ?jīng)壓榨或浸提取油后的副產(chǎn)物。其營養(yǎng)豐富，粗蛋白質(zhì)含量為44%～47%；多糖含量高達32.5%；膽固醇含量低，可消化率高，更容易被動物或人體消化吸收 （張姣勤等，2008；梅娜，2007）， 并含有 Mg、K、Ca、Fe、Na、Zn、P、Cu、Mn等多種礦質(zhì)元素及具有抗衰老、抗癌功效的黃酮類物質(zhì)，同時還含有較少的抗營養(yǎng)因子，因此，綜合營養(yǎng)價值高（Hwang等，2010）。目前花生粕常被用作飼料原材料以及用來開發(fā)植物源多肽（Yang等，2016），賦予花生粕新的功能特性。然而，花生或花生粕在生長、儲藏和轉(zhuǎn)運過程中易受到霉菌毒素的污染，特別是黃曲霉毒素，這將嚴重影響到花生農(nóng)產(chǎn)品及其副產(chǎn)品的質(zhì)量安全。如何解決花生及其副產(chǎn)品的霉菌毒素污染問題，已成為一個亟待解決的難題。

目前，黃曲霉毒素的去除方法主要包括物理法、化學法和生物法。物理法主要包括溶劑萃取、吸附、加熱、輻射、太陽照射等，但這些方法具有工藝復雜、成本較高、耗費人力、受環(huán)境因素影響、毒素去除效果低等缺點，實際生產(chǎn)中己不再常見。近年來，應用較多的物理脫毒法是依靠霉菌毒素脫毒劑的吸附作用（關(guān)心，2016）?；瘜W法主要是使用化學試劑除去毒素，使用的化學試劑主要有次氯酸鈉、臭氧、過氧化氫、氫氧化鈉、氨水以及氯氣等。但添加的化學藥品及反應的副產(chǎn)物會嚴重破壞飼料的營養(yǎng)成分，降低飼料的食用價值；殘留的化學藥品會影響飼料的色澤與氣味，進而影響動物的采食量，抑制動物的生長（李俊霞，2007）。生物法主要利用的是物理吸附結(jié)合毒素（酵母、乳酸菌等）、分泌活性物質(zhì)降解毒素兩個途徑，并且生物法不但處理條件溫和，不會破壞產(chǎn)品品質(zhì)，而且有些還能增加產(chǎn)品營養(yǎng)價值（劉睿杰等，2012）。但是目前國內(nèi)外的研究多集中在利用微生物分泌活性物質(zhì)降解毒素，因為微生物的物理吸附作用存在著結(jié)合可逆不穩(wěn)定，毒素易重新釋放，引起二次污染的問題，加之吸附效果受菌種、環(huán)境等條件限制，致使菌體吸附不是清除黃曲霉毒素的最佳選擇（關(guān)心，2016）。

目前，用于生物降解的主要菌種既包括黑曲霉（李冰等，2012）、黃曲霉（Das等，2015）及假蜜環(huán)菌（劉大嶺等，2003）等真菌類，又包含枯草芽孢桿菌（趙麗紅等，2014）、紅色黏球菌（王寧等，2009）及紅球菌（Eshelli等，2015）等細菌類。 然而，上述菌種之間降解黃曲霉毒素的效果差異較大，同時部分菌株仍然以吸附作用結(jié)合毒素，無法達到理想的去除效果。鑒于此，本研究以香豆素為唯一碳源和能源，對待選菌株進行初篩，進一步通過與黃曲霉毒素（AFB1）共培養(yǎng)方式，復篩獲得高效去除黃曲霉毒素的菌株，然后在含有黃曲霉毒素的花生粕培養(yǎng)基中驗證，并對高效菌株去除黃曲霉毒素的特性進行初步研究，為分離純化具有去除黃曲霉毒素的物質(zhì)和探索其降解機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 候選菌種 芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌），霉菌（黑曲霉、米曲霉），酵母（產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母），乳酸菌（植物乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌），均由中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所基因工程研究室保存提供。

1.1.2 花生粕 花生粕購自山東魯花集團有限公司，粉碎過40目篩備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 菌種活化培養(yǎng)基 霉菌、酵母培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），芽孢桿菌培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基，乳酸菌培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3.2 擴大培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基（液體）。

1.1.3.3 篩選培養(yǎng)基 初篩無機鹽培養(yǎng)基：改良Hormisch 篩 選培 養(yǎng)基 ，KH2PO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KNO30.5 g， （NH4）2SO40.5 g，Ca-Cl2·2H2O 0.005 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.003 g，pH 7.0；H2O 1000 mL，121℃高壓滅菌20 min后加入1 g香豆素。固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉，用于AFB1降解菌株的初步篩選。

復篩培養(yǎng)基：相應菌種活化培養(yǎng)基。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：滅菌后的基質(zhì)（90%花生粕和10%麩皮）和水按 1∶1（m/m）的比例混合，自然 pH。

1.1.4 試劑 黃曲霉毒素B1、香豆素，購自北京百 靈 威 科 技 有 限 公 司 ；KH2PO4、MgSO4·7H2O、KNO3、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、FeCl3·6H2O 均為分析純。

1.1.5 設(shè)備 離心機（3H16RI），湖南赫西儀器設(shè)備有限公司；酶標儀（DNM-9602），北京普朗新技術(shù)有限公司；均質(zhì)器（SCIENTZ-09），寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化與擴培

1.2.1.1 芽孢桿菌 保藏菌種劃線 （或涂布）LB固體平板，37℃倒置培養(yǎng)18 h后，挑取單菌落或刮取一環(huán)接入20 mL液體種子培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，在37℃，150 r/min條件下，培養(yǎng)24 h；然后50 mL三角瓶裝液20 mL，接種量0.1 mL，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)8～10 h備用。

1.2.1.2 霉菌 保藏的斜面菌種轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，長滿大量黑色（黑曲霉）或黃綠色（米曲霉）孢子，即為活化的斜面種子。用無菌移液管吸取5 mL無菌水加至斜面上，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，裝入含有玻璃珠的三角瓶中，蓋好塞子振蕩數(shù)分鐘，即可用作液體種子。血球計數(shù)板計數(shù)孢子懸液的濃度。

1.2.1.3 酵母菌活化 保藏菌種劃線PDA固體平板，30℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，再挑單菌落于液體PDA培養(yǎng)基中，置于30℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)擴陪15～20 h，然后50 mL三角瓶裝液20 mL，接種量0.1 mL，30℃，150 r/min搖床培養(yǎng)12～14 h備用。

1.2.1.4 乳酸菌活化 保藏菌種劃線MRS固體平板，靜置2 min，然后上面再倒一層MRS固體培養(yǎng)基，37℃恒溫靜置培養(yǎng)18 h，挑取單菌落接種到少量MRS液體培養(yǎng)基 （50 mL三角瓶裝20 mL），然后再倒入一定量的MRS培養(yǎng)基到三角瓶頸部，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h；然后50 mL三角瓶裝液50 mL，接種量3%，37℃，靜置培養(yǎng)14～16 h備用。

1.2.2 去除AFB1菌的篩選

1.2.2.1 初篩 將上述8種菌，按照1.2.1中方法活化培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將菌液接種于初篩培養(yǎng)基（液體）中，37℃或30℃振蕩或靜置培養(yǎng)2～5 d，觀察菌株的生長情況。若變渾濁，取樣劃線于初篩培養(yǎng)基平板上，37℃或30℃培養(yǎng)，生長后挑取菌落，在初篩培養(yǎng)基上傳代3次，保存能以香豆素為碳源生長的菌株做進一步篩選。

1.2.2.2 復篩 取初篩菌株分別接種于5 mL相應種子培養(yǎng)基中，相應溫度靜置或振蕩培養(yǎng)相應時間，接著再以5%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL活化培養(yǎng)基中，相應溫度靜置或振蕩培養(yǎng)相應時間，取975μL菌體發(fā)酵液與25μL AFB1標準品（100μg/mL）置于滅菌的1.5 mL離心管中，使其毒素終濃度為2.5μg/mL，以無菌的復篩培養(yǎng)基加AFB1作為空白對照，于暗處在相應溫度靜置或振蕩培養(yǎng)72 h，3次平行。反應結(jié)束后，離心去除菌體，取其上清液測樣。

1.2.2.3 驗證 取復篩陽性菌株，活化后，按照5%接種量接種于含有毒素終濃度為2.5μg/g的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于暗處在相應溫度靜置或振蕩培養(yǎng)72 h，3次平行，每12 h翻料一次。對照組在不接種菌種的情況下同樣品處理。反應結(jié)束后，利用同體積甲醇水（7∶3）浸提，用玻棒攪拌，超聲萃取 10 min后，4℃，8000 r/min離心 10 min，取上清待測。

1.2.3 高效菌株去除AFB1特性研究 取適量高效菌株培養(yǎng)液，4℃，8000 r/min離心 15 min，分別收獲上清液和菌體。菌體用無菌PBS（pH 7.0）洗滌、離心 3次后加入5 mL無菌PBS（pH 7.0）制成菌懸液。菌體加入 5 mL無菌PBS（pH 7.0）混勻，超聲波破碎 30 min后離心，離心上清液過0.22μm濾膜，制得胞內(nèi)液。將培養(yǎng)液、上清液、菌懸液、胞內(nèi)液分別加入 AFB1標準品，使 AFB1終濃度為 2.5 μg/mL，以 PBS（pH 7.0） 加 AFB1作為空白對照，37℃，150 r/min暗處振蕩培養(yǎng)72 h，檢測各組分AFB1去除率。

1.2.4 AFB1去除率的測定 AFB1去除率的測定采用酶聯(lián)免疫法（ELISA），具體方法見試劑盒說明書，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

2 試驗結(jié)果

2.1 初篩 香豆素作為唯一的碳源和能源對8株目標菌株進行初篩發(fā)現(xiàn)，共有4株菌株具有較好的生長情況，包括2株芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌），一株酵母菌（釀酒酵母）和一株乳酸菌（植物乳桿菌），具體結(jié)果見表1。

表1 8株目標菌株初篩結(jié)果

2.2 復篩 由圖1可知，初篩中四株具有去除香豆素能力的菌株對AFB1也均有不同程度的去除能力。其中，枯草芽孢桿菌最好，去除率達到（60.73±0.83）%，釀酒酵母次之，為（56.87±1.29）%。

圖1 復篩菌株對AFB1的去除率

2.3 驗證 根據(jù)圖2結(jié)果顯示，在花生粕中，4株復篩菌株對AFB1的去除率較復篩過程有所降低，尤其是釀酒酵母和植物乳桿菌，分別下降了71.71%和80.87%。另外，枯草芽孢桿菌對AFB1的去除率依然最高，達到了（37.39±2.05）%，次之是地衣芽孢桿菌，去除率為（32.65±2.50）%。選擇枯草芽孢桿菌為后續(xù)研究菌株。

圖2 復篩菌株在花生粕中對AFB1的去除率

2.4 高效菌株去除AFB1特性 圖3比較了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液、上清液、菌懸液和胞內(nèi)液對AFB1的去除能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液和上清液分別保持了較高的AFB1去除能力，分別達到了（59.19±2.09）%和（57.65±1.50）%，而菌懸液和胞內(nèi)液雖有一定的去除能力，但均在20%以下，胞內(nèi)液甚至不足10%。

圖3 枯草芽孢桿菌各組分對AFB1的去除能力

3 討論

AFB1標準品毒性極強、對操作者有危險并且價格昂貴，而香豆素是一種可人工合成的化工原材料，無毒較安全，價格低廉，易于獲得。因此選取結(jié)構(gòu)相似的香豆素作為唯一碳源和能源。先用香豆素液體培養(yǎng)基作為初篩培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基試管置于恒溫搖床培養(yǎng)，好氧菌株（芽孢桿菌、酵母菌）在氧量豐富的培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖迅速，而兼性厭氧菌株（乳酸菌）通過加大裝液量、減少氧氣存在量以及提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)的方法，使其快速繁殖生長，從而保證了具有利用香豆素能力的菌株在沒有其他條件影響的情況下正常生長。然后再利用固體平板對有生長的菌株進行3次驗證，保證了篩選效果的準確性。通過本方法，初篩過程共篩選得到4株細菌能利用香豆素并生長良好，而復篩結(jié)果也證明4株香豆素篩選菌株均能不同程度的去除AFB1，再次驗證了香豆素篩選法在去除AFB1目的菌株的篩選中是切實可行的。

經(jīng)過驗證過程發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對于AFB1的去除能力較強，這和玉孫玲玉 （2014）的研究結(jié)果相一致，但是利用地衣芽孢桿菌降解AFB1的研究還鮮見報道。同時酵母、乳酸菌也表現(xiàn)出一定的去除能力，這和張秀江等 （2016）的研究結(jié)果近似，但去除能力上稍顯不足。但本研究結(jié)果顯示，2株真菌 （黑曲霉和米曲霉）并沒有表現(xiàn)出相應的AFB1去除能力，這和張曉雪等 （2017）等的結(jié)果不一致，這可能與菌株的來源不同有關(guān)。

微生物對 AFB1的脫毒作用有 2種情況，吸附或降解。根據(jù)驗證試驗結(jié)果，釀酒酵母和植物乳桿菌發(fā)酵含有AFB1的花生粕后，經(jīng)過超聲處理后，去除率大幅下降，這說明酵母菌和乳酸菌對AFB1的去除作用主要體現(xiàn)在吸附性能上 （劉暢等，2010）。然而，也有研究表明，酵母菌對AFB1也有一定的降解作用（張高娜 等，2013），并且還和其細胞壁有一定的關(guān)系（徐智鵬 等，2015）。而對于芽孢桿菌則對超聲處理影響不大，這說明芽孢桿菌對AFB1的去除作用主要是其代謝產(chǎn)物的降解作用，而其去除AFB1活力的下降（與復篩相比）與芽孢桿菌在以花生粕為基質(zhì)的培養(yǎng)基上生長情況一般有關(guān)（楊新建 等，2015）。另外，圖3的結(jié)果進一步驗證了上述的結(jié)果，枯草芽孢桿菌去除AFB1的能力主要依靠的是由其菌體細胞代謝產(chǎn)生并分泌至胞外的某種活性物質(zhì)的生物降解作用，而不是菌體本身的吸附作用，具體該活性物質(zhì)的種類和特性還有待采取加熱、蛋白酶K處理等措施進一步分析和研究。

4 結(jié)論

本研究通過利用香豆素為唯一碳源，經(jīng)過初篩和復篩過程，篩選出2株芽孢桿菌、1株乳酸菌和1株酵母菌具有AFB1去除能力；同時利用驗證過程，初步確定了4株菌對AFB1的去除特性，并根據(jù)去除率的高低，篩選了枯草芽孢桿菌為后續(xù)研究的目標菌株；通過枯草芽孢桿菌各組分去除AFB1能力的比較，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌去除AFB1的能力主要由菌體代謝產(chǎn)生的某種活性物質(zhì)主導，并提示其是一種胞外物質(zhì)。為后期分離純化該菌株去除AFB1的活性物質(zhì)，研究其作用機制，以及其在花生粕脫毒上的具體應用提供基礎(chǔ)。